山茶籽對雌激素缺乏AD大鼠腦組織形態、β淀粉樣蛋白及學習行為能力的影響

周善金 李海 顧建忠 韋福相 邱迎均 潘春玲 黎飚 方曉燕

(右江民族醫學院組織胚胎學教研室，廣西 百色 533000)

阿爾茨海默病(AD)患病率隨著年齡增大明顯升高，老年女性發病率更高，臨床表現更重。沉積于海馬區β淀粉樣蛋白(Aβ)引起思維、語音中樞的損傷是AD的病因之一〔1～3〕。本研究主要觀察山茶籽提取物對雌激素缺乏AD模型鼠的學習行為能力、對應組織的Aβ沉積的影響，為臨床防療AD提供新的治療方案，無毒高效地提高AD女性患者生活質量，使茶麩變廢為寶，為廣大山區脫貧綠色生態產業帶來經濟效益和社會效益。

1 材料與方法

1.1實驗動物飼養 SD大鼠，SPF級5月齡雌性大鼠32只，體重(350±10)g。在室溫(25±3)℃、燈光每12 h 進行交替，相對濕度58%的條件中給予全效顆粒飼料喂養，自由飲水。

1.2雌激素缺乏AD大鼠模型的建立 取24只大鼠在麻醉條件下(10 g/L 戊巴比妥鈉通過腹腔注射，3.0 mg/kg)，常規消毒，切掉兩側卵巢，縫合創口。切片鏡下鑒定切除組織塊為卵巢。術后創口處用鏈霉素治療3 d，避免創口感染。去卵巢后2 w，按上述方法麻醉(3.0 mg/kg)，固定于腦定位器上，頭顱正頂部中央切前囟口暴露腦組織，以前囟為中心，向后4.3 mm、再旁開2.1 mm兩邊為穿刺點，打孔鉆開顱骨。距離腦膜表面針入3.0 mm到達海馬區雙側，用Aβ25～35 1 μl(含量為10 μg)緩緩注入海馬區雙側，留針片刻(5 min)，使Aβ25～35充分局部浸潤。③造模大鼠顱內注射3 d后，再用D-半乳糖腹腔注射，注射液用D-半乳糖(100 mg/kg)+生理鹽水稀釋至2 ml，1次/d，連續2 w。對照組大鼠與去卵巢+D-半乳糖聯合造AD模大鼠的摘除卵巢的手術操作過程一樣，不同是切除卵巢附近一塊脂肪組織，同樣定位開顱，在相應部位注射等量鹽水，沒有注射Aβ25～35。

1.3動物分組及給藥 造模+山茶籽干預(山茶籽)組用相當于生藥5 g/g山茶籽的水溶液定時定量灌胃〔10 ml/(kg·d)〕；造模+雌二醇干預(雌二醇)組用雌二醇皮下注射200 μg/kg,2次/w；對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。各組造模后均給藥12 w。

1.4Morris水迷宮試驗 各實驗大鼠在造模后給藥前及給藥12 w時全部進行Morris 水迷宮，測定大鼠學習行為能力。在水迷宮中央放置圓形的平臺深度位于1.5 cm水下處，測定大鼠空間行為能力和空間判斷記憶能力。

1.5免疫組化觀察不同組海馬區腦組織切片Aβ陽性細胞 灌注排血取腦，麻醉大鼠后，切開胸腔心臟，用500 ml生理鹽水快速灌注。灌注后斷頭常規取腦，左腦用10%甲醛固定腦組織，脫水、包埋和切成腦組織片。右大腦勻漿測定Aβ。海馬區腦組織切片免疫組化染色，將海馬區腦組織切片室溫中干燥1.5 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，每次20 min。將山羊血清(混有0.1%TritonX-100)注入組織片上并進行35～50 min孵育。滴入抗Aβ抗體(1∶400)4℃條件下孵育一夜。第2天，用Cy3 標記的二抗體(1∶200)在濕盒中進行2～3 h孵育。最后，免疫染色切片顯微鏡觀察切片陽性細胞，進行Aβ陽性細胞計數。

1.6Western印跡法檢測Aβ 右側海馬區組織在低溫條件下進行勻漿并提取Aβ進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。凝膠置電泳槽里，并注入緩沖電泳液檢查其密封性。向電泳樣本加入適當5×結合緩沖液,煮沸時間10 min，進行離心分離。在泳道注入40 μg Aβ，蛋白條帶至中間部位即可斷電。剪濾紙與聚偏氟乙烯(PVDF)膜一樣大小，并在甲醇溶液中浸泡PVDF 膜5 min左右，夾子內部海綿、濾紙、凝膠板、PVDF 膜、濾紙按順序排列。通電90 min，電壓100 V電泳。室溫轉膜后，5%牛奶液中進行封閉2 h，加入一抗孵育4℃過夜(其中兔抗Aβ單克隆抗體1∶400；兔抗大鼠β-actin 多克隆抗體1∶10 000)。用TBST洗滌3次。加入酶標記兔二抗(1∶20 000)孵育2 h。同樣洗滌3次。觀察凝膠成像，掃描觀察灰度。

1.7統計學方法 采用SSPS19.0軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1各組大腦組織結構比較 對照組神經細胞大小、分布和數量正常，模型組神經細胞數量減少，大量神經元纖維纏結，而山茶籽組和雌二醇組的神經細胞大小、分布和數量與對照組相近。見圖1。

圖1 各組大腦組織結構(HE，×100)

2.2各組腦組織Aβ蛋白表達比較 見圖2。模型組Aβ電泳條帶較對照組顯著增強，山茶籽組及雌二醇組Aβ條帶與對照組接近。

2.3各組水迷宮實驗 見表1。對照組給藥前后到達時間和錯誤率沒有顯著差別(P>0.05)；模型組治療前后到達時間和錯誤率有顯著差別(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，山茶籽組及雌二醇組治療后錯誤率均明顯降低(P<0.01)；與雌二醇組比較，山茶籽組用藥后錯誤率無明顯差異(P>0.05)。

圖2 Western印跡檢測各組Aβ蛋白表達

表1 各組到達中央平臺時間和錯誤率比較

2.4各組海馬區組織切片Aβ陽性細胞計數比較 與對照組〔(8.33±0.62)個〕比較，模型組海馬區組織切片Aβ陽性細胞計數〔(72.10±8.79)個〕顯著增多(P<0.01)；與模型組比較，山茶籽組〔(21.32±3.05)個〕及雌二醇組〔(17.19±1.03)個〕Aβ陽性細胞計數顯著減少(P<0.01)。

3 討 論

去卵巢模擬老年女性卵巢功能退化加常規用D-半乳糖+Aβ聯合造AD模，結果AD模型大鼠學習行為和記憶能力下降明顯,海馬組織Aβ沉積增加明顯，其陽性細胞增加，相應 Aβ電泳帶光密度明顯增加，說明此方法造AD模成功。

雌激素缺乏AD模型經山茶籽提取液干擾后，大鼠記憶行為和學習能力提高,海馬區組織神經細胞數量增加，神經纖維纏結減少，海馬區Aβ免疫組織化學染色顯示Aβ染色細胞數量下降，說明山茶籽對AD大鼠治療效果顯著，山茶籽發揮雌激素樣作用抑制膽堿酶，增加膽堿在腦組織的生理活性濃度，提高腦中樞組織生理活動〔4〕，從而表現為學習行為和記憶能力提高；雌激素大量羥基發揮抗氧化功能〔5〕，抑制半乳糖和Aβ沉積物對神經組織的傷害，抑制AD發生和發展；雌激素有擴張血管，增血流的功效，減少Aβ對腦組織在大腦組織堆積、神經纖維纏結和老年斑生成〔6，7〕；山茶籽發揮其雌激素樣作用增加中樞神經細胞α酶的分泌，加快Aβ水解、排出，AD自然得到改善〔8〕。

綜上，山茶籽干擾AD大鼠效果良好，其原理是內含豐富植物性雌激素。與雌二醇治療比較，山茶籽治療AD作用效果相近，也從另一方面說明山茶籽內含雌激素〔9〕，而且山茶籽無雌激素的毒副作用，為老年女性AD防治提供新方案，還可以發揮山茶籽綠色生態扶貧產業作用。