烏頭湯對痛性糖尿病周圍神經病變大鼠疼痛行為及KCNQ2/5通道蛋白表達的影響

馬運濤 祁樂

(1天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381；2天津中醫藥大學)

糖尿病周圍神經病變(DPN)是糖尿病常見的慢性并發癥，也是糖尿病患者致殘的主要原因之一。其中約1/3的患者會發生痛性DPN(PDPN)〔1〕，以肢體遠端受累為主，可有針扎樣、燒灼樣、撕裂樣、觸碰敏感性疼痛等多種臨床表現，疼痛常在夜間加重。PDPN屬于神經病理性疼痛，其神經痛主要原因在于外周神經受損〔2〕，其發病機制除受自身遺傳因素影響外，還可通過氧化應激損傷、血管損害、代謝紊亂等影響患者的血管及神經，造成神經變性壞死，嚴重影響神經的傳導速度與敏感性。而且近年來亦有國內外諸多研究證實PDPN發生與電壓門控鉀離子通道(KCNQ)功能障礙相關。鉀離子通道廣泛分布于各組織細胞表面，尤其對神經細胞的膜電位和興奮性起重要作用，其中KCNQ2/5蛋白表達和活性水平下調，在PDPN發病機制中起到關鍵性作用〔3〕。有研究證實烏頭湯對急慢性疼痛有鎮痛作用，也具有抗炎、抗氧化和免疫調節的生物活性的作用〔4〕。臨床以烏頭湯辨證加減治療PDPN，根據患者臨床表現酌情增加川烏劑量，可顯著改善患者肢體疼痛、麻木的癥狀，并可獲得持續性療效〔5〕。本研究通過觀察烏頭湯對PDPN大鼠痛覺行為指標及KCNQ2/5通道蛋白表達的影響，探討烏頭湯治療PDPN的內在作用機制，為臨床治療PDPN提供依據和方法。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級健康雄性Wistar大鼠150只，體重(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號SCXK(京)2016-0011。適應性喂養1 w后隨機分為正常組30只，造模組120只。

1.2實驗藥物 鏈脲佐菌素(STZ，100 mg，sigama，產品批號：s0130)；烏頭湯中藥配方顆粒由四川新綠色藥業科技發展有限公司提供。制川烏(產品批號：18110132)、麻黃(產品批號：18100067)、黃芪(產品批號：19090015)、白芍(產品批號：19080023)、甘草(產品批號：19100006)。

1.3模型制備與分組 正常組普通飼料喂養，造模組高脂飼料喂養8 w后，造模組大鼠尾靜脈注射2%鏈脲佐菌素-檸檬酸鈉混合溶液(25 mg/kg)，正常組大鼠尾靜脈注射同等劑量(25 mg/kg)檸檬酸鈉緩沖液，1 w后造模組大鼠血糖大于16.7 mmol/L則為糖尿病模型大鼠。普通飼料喂養4 w后測量糖尿病大鼠熱痛覺及機械性痛覺篩選出PDPN大鼠模型。成功造模112只，隨機分為模型組28只，烏頭湯低、中、高劑量組各28只。

1.4干預方法 烏頭湯低、中、高劑量組分別予以烏頭湯中藥配方顆粒4.5 g/(kg·d)、 9.0 g/(kg·d)、18.0 g/(kg·d)，用生理鹽水配成混懸液，按10 ml/kg容積灌胃；正常組與模型組分別灌胃予以同等容積的生理鹽水，每日1次，連續12 w。

1.5檢測指標與方法

1.5.1大鼠一般狀況及體重 觀察大鼠精神狀態，反應情況，活動情況，進食、飲水、排尿、排便情況，毛發光澤度，尾靜脈注射處有無感染、壞死等一般情況。給藥前及給藥過程中每4 w測量一次體重，做好記錄。

1.5.2大鼠血糖監測 給藥前及給藥過程中每4 w通過大鼠目內眥取血，測量各組大鼠空腹血糖。

1.5.3大鼠50%縮足反應閾值監測 采用弗萊毛(von Frey hair，North Coast，美國)細絲測定大鼠神經50%縮足反應閾值。將大鼠置于高架金屬網格內，適應15 min 后，用不同力度的 von Frey 細絲刺激大鼠右后足底中部皮膚，觀察其有無縮足或舔足反應。從有陽性反應起連續測量5次，記錄相應的細絲力度(f)，通過公式計算其50%縮足反應閾值。

1.5.4大鼠甩尾時間監測 將大鼠尾部下1/3浸入溫度設置為(52.5±0.5)℃水浴鍋中，儀器自動記錄鼠尾從浸入水面到甩離水面的時間，剔除時間小于0.1 s及大于20 s的數值。

1.5.5大鼠坐骨神經電鏡觀察 給藥12 w結束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后處死，取雙側坐骨神經約1 cm，置于4%多聚甲醛中固定24 h后，充分流水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明石蠟包埋，厚度2 μm連續病理切片，分別進行蘇木素染色、伊紅染色后，進行脫水封片，在電鏡下觀察超微結構。

1.5.6大鼠L4～6背根神經節及脊髓KCNQ2/5通道蛋白表達 給藥12 w結束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后處死，取L4～6背根神經節和脊髓組織，4℃生理鹽水沖洗后，放入凍存管中，-80℃冰箱保存。取相應組織稱重，進行總蛋白提取，測定蛋白含量及蛋白變性后，在電泳槽內上樣電泳及轉膜，將轉膜后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入封閉液中，室溫搖床緩慢封閉2 h，分別加入兔抗KCNQ2/5多克隆抗體，4℃冰箱孵育過夜，TBST溶液快速漂洗，滴加二抗孵育，顯影后進行Western印跡曝光成像拍照分析，應用Image J分析目的蛋白條帶的灰度值與β-actin內參條帶的灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.6統計方法 采用SPSS17.0軟件進行配對t檢驗(方差不齊時采用t′檢驗)、單因素方差分析。

2 結 果

2.1大鼠一般情況 正常組大鼠精神狀態良好，毛發潔凈純白有光澤，反應敏捷，飲食水及尿量正常；模型組大鼠精神萎靡，毛色枯黃少光澤，行動遲緩，出現“三多一少”的典型癥狀，飲食水及尿量均明顯增加；烏頭湯治療組大鼠與模型組比較精神狀態稍好，行動較活躍，但飲食水及尿量情況無明顯變化。

2.2各組不同時間點體重比較 給藥前模型組及烏頭湯各劑量組體重較正常組明顯升高(P<0.01)，模型組與烏頭湯組體重無顯著性差異(P>0.05)；給藥4 w時，模型組體重較正常組明顯升高(P<0.01)，烏頭湯低、中劑量組體重較模型組明顯降低(P<0.01)，烏頭湯高劑量組體重與模型組無顯著性差異(P>0.05)；給藥8 w時，正常組、模型組及烏頭湯高劑量組體重無顯著性差異(P>0.05)，烏頭湯低、中劑量組體重較模型組降低(P<0.05)；給藥12 w時，正常組較模型組體重明顯升高(P<0.01)，烏頭湯低、中劑量組體重較模型組降低(P<0.05)，烏頭湯高劑量組體重與模型組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點體重及血糖比較

2.3各組不同時間點血糖比較 同一時間點，模型組較正常組血糖明顯升高(P<0.01)；給藥前，模型組與烏頭湯各劑量組血糖無顯著性差異(P>0.05)；給藥4 w時，烏頭湯低、中、高劑量組較模型組血糖明顯降低(P<0.01)；給藥8 w時，烏頭湯低、高劑量組較模型組血糖降低(P<0.05)，烏頭湯中劑量組與模型組血糖無顯著性差異(P>0.05)；給藥12 w時，烏頭湯低、中、高劑量組與模型組血糖無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.4各組不同時間點50%縮足反應閾值比較 給藥前，模型組及烏頭湯各劑量組50%縮足反應閾值較正常組明顯升高(P<0.01)，模型組與烏頭湯各劑量組50%縮足反應閾值無顯著性差異(P>0.05)；給藥4 w時，模型組50%縮足反應閾值較正常組明顯升高(P<0.01)，烏頭湯中、高劑量組50%縮足反應閾值較模型組明顯降低(P<0.01)，烏頭湯低劑量組較模型組50%縮足反應閾值無顯著性差異(P>0.05)；給藥8 w及12 w時，模型組50%縮足反應閾值較正常組明顯升高(P<0.01)，烏頭湯低、中、高劑量組50%縮足反應閾值較模型組明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組不同時間點50%縮足反應閾值比較

2.5各組不同時間點甩尾時間 給藥前，模型組及烏頭湯各劑量組甩尾時間較正常組明顯延長(P<0.01)，模型組與烏頭湯各劑量組甩尾時間無顯著性差異(P>0.05)；給藥4 w時，各組甩尾時間無顯著性差異(P>0.05)；給藥8 w時，模型組甩尾時間與正常組及烏頭湯高劑量組無顯著性差異(P>0.05)，烏頭湯低、中劑量組甩尾時間較模型組顯著縮短(P<0.01，P<0.05)；給藥12 w時，模型組甩尾時間較正常組明顯延長(P<0.01)，烏頭湯低、中、高劑量組甩尾時間較模型組明顯縮短(P<0.01)。見表3。

表3 各組不同時間點甩尾時間比較

2.6坐骨神經病理學觀察 正常組坐骨神經排列緊密、結構整齊有序，神經纖維髓鞘致密、均勻，排列規則且層次分明，其間散見雪旺細胞。模型組坐骨神經排列混亂，結構疏松無序，神經纖維髓鞘明顯增寬，分布不均勻，板層結構紊亂，有的出現節段性脫髓鞘，軸索萎縮，部分雪旺細胞變性壞死，上述病理改變提示PDPN模型造模成功。烏頭湯低、中、高劑量組坐骨神經病理損傷與模型組相比，均有不同程度的改善，神經排列相對緊密，結構相對整齊有序，髓鞘分布相對均勻。見圖1。

2.7L4-6背根神經節KCNQ2、KCNQ5蛋白相對表達量 與正常組相比，模型組KCNQ2、KCNQ5蛋白相對表達量均明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，烏頭湯低、中、高劑量組KCNQ2、KCNQ5蛋白相對表達量均明顯升高(P<0.01)。與正常組相比，烏頭湯高劑量組KCNQ5蛋白相對表達量明顯升高(P<0.01)，烏頭湯中、高劑量組KCNQ2蛋白相對表達量明顯升高(P<0.01)，見表4、圖2。

圖1 各組坐骨神經病理學觀察(×400)

表4 各組KCNQ2、KCNQ5蛋白表達比較

1～5：正常組、模型組、烏頭湯低劑量組、烏頭湯中劑量組、烏頭湯高劑量組圖2 Western 印跡檢測KCNQ2、KCNQ5蛋白表達

3 討 論

PDPN是因糖尿病導致周圍神經結構和功能改變而誘發的慢性神經病理性疼痛。PDPN患者的感覺障礙比較明顯，除病變處的麻木感、震動感及患者的感覺減退、喪失外，更多表現為自發性疼痛〔6〕。隨著對糖尿病并發癥的深入研究，PDPN的發病機制也有著廣泛的探討，主要包括：代謝紊亂、血管損害、神經營養因子、氧化應激的損傷、炎癥反應、自身免疫的損傷、遺傳因素、神經元細胞膜離子通道功能障礙、蛋白激酶(PK)C、致痛因子等〔7〕。雖然其具體的發病機制尚不明確，但由于胰島素分泌不足及外周血管功能不全所導致的神經損傷這一病理因素已得到共識。

鉀離子通道是選擇性鉀離子通道，廣泛分布于骨骼肌、神經、血管、胃腸道及腺體細胞中，在調節神經細胞興奮性及膜電位中起重要作用。電壓門控鉀離子通道KCNQ屬于延遲整流型鉀離子通道，其中KCNQ2/5通道參與構成M電流，M電流是一種具有電壓依賴性、慢激活、非失活、慢去活的外向鉀電流，對于維持和穩定神經元的興奮性發揮著重要作用〔8〕。Everill等〔9〕研究證實，神經元損傷后M電流減少，可致神經興奮性升高，從而出現痛覺過敏。亦有學者報道KCNQ2/5開放劑瑞替加濱可有效治療神經結扎模型所產生的神經病理性疼痛〔10〕。所以KCNQ2/5通道電流在神經病理性疼痛中發揮關鍵作用，從而上調KCNQ2/5蛋白表達，增強KCNQ2/5通道的開放可作為疼痛治療的思路。

本研究提示PDPN大鼠的神經損傷得到一定程度的修復。經烏頭湯治療后PDPN大鼠機械痛覺及熱痛覺敏感性均較模型組增強，也證實其神經傳導速度的提高。說明烏頭湯具有改善PDPN大鼠對于機械痛覺及熱痛覺的敏感程度，修復受損神經、改善神經傳導功能，從而起到緩解PDPN疼痛的作用。模型組PDPN大鼠KCNQ2/5蛋白表達較正常組均明顯下降，從而導致M電流減弱，神經元興奮性增加，產生神經病理性疼痛。經烏頭湯低、中、高劑量灌胃治療后大鼠KCNQ2/5蛋白表達較模型組均明顯升高；與正常組相比，烏頭湯中、高劑量組KCNQ2/5蛋白表達亦有不同程度升高，證實烏頭湯可上調KCNQ2/5通道的表達，增強M電流，使神經元維持正常的興奮狀態，從而減輕疼痛，且其療效與藥劑量呈正相關性。綜上，烏頭湯可修復PDPN大鼠受損神經，提高神經傳導功能，改善對于機械痛覺及熱痛覺的敏感程度，同時可修正KCNQ2/5通道的表達和活性，從而減輕PDPN所引起神經性疼痛癥狀，為其進一步臨床應用奠定了理論基礎。