微生態制劑對小鼠潰瘍性結腸炎的作用

陳巖勤 李玉桂 楊盛剛 王聰 高秀麗,2,3

(貴州醫科大學 1藥學院，貴州 貴陽 550025；2微生物與生化藥學工程中心；3藥用植物功效與利用國家重點實驗室)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種以腹痛、腹瀉、便血等為特征的易復發性炎癥性腸病〔1〕，近幾年尤其是在亞洲，南美和中東地區其發病率持續上升〔2,3〕。迄今UC尚缺乏有效的藥物來治愈，研究者認為UC的病因和發病機制與遺傳因素、環境因素、腸道菌群和異常免疫反應等多種因素有關〔4〕。 UC患者與正常人群相比腸道中條件致病菌數量明顯增多，而且雙歧桿菌、乳酸菌等腸道正常菌群的數量明顯下降〔5,6〕。秦廣大等〔7〕將枯草桿菌和屎腸球菌(美常安)與青春雙歧桿菌(麗珠腸樂)分別與柳氮磺胺吡啶聯用治療30例輕中度活動期UC患者，結果表明使用柳氮磺胺吡啶聯合微生態制劑用于輕中度活動期UC的臨床療效優于單獨使用柳氮磺胺吡啶。房玉海〔8〕將美沙拉嗪與美常安聯合運用治療94例UC患者1個月，結果表明不良反應相對較少。另有研究表明中藥小檗堿通過調節腸道菌群〔9〕和調節免疫應答〔10～14〕對UC具有良好的療效。本課題組通過建立與人類UC相似的葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導動物UC模型，探討微生態制劑治療UC的作用效果，為后續微生態制劑的實驗研究和臨床合理應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 70只SPF級雌性昆明小鼠，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，體重(20±2.0)g，動物合格證號：SYXK(黔)2018-0001。

1.1.2藥物、試劑及儀器 DSS(上海翊圣生物科技有限公司，D9606)；柳氮磺胺吡啶(上海福達制藥有限公司，22160610)；鹽酸小檗堿片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，2160929)；乳酸菌(商品名：聚克，江蘇美通制藥有限公司，170617)；枯草桿菌(商品名：枯草桿菌，華潤紫竹藥業有限公司，53160601)；地衣芽孢桿菌(商品名：地衣芽孢桿菌，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，201706100)；白細胞介素(IL)-17A(037864)、IL-6(002293)、IL-10(002285)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(002095) 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。酶標儀(RT-6100)由Rayto公司生產；TG16W 微量高速離心機由三和儀器源頭廠家生產；石蠟切片機由LEIKA公司生產；HT-200 恒溫搖床源于赫田儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1模型動物分組 小鼠適應性喂養1 w，隨機抓取分組，每組10只，分為對照組、模型組、柳氮磺吡啶組、小檗堿組、乳酸菌組、枯草桿菌組、地衣芽孢桿菌組。動物實驗遵循貴州醫科大學實驗動物倫理委員會章程。

1.2.2造模及用藥 對照組自由飲用無菌蒸餾水，每日同時間點給予生理鹽水，灌胃體積0.2 ml/10 g，連續灌服7 d；模型組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點給予生理鹽水，灌胃體積0.2 ml/10 g，連續灌服7 d；柳氮磺胺吡啶組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按100 mg/kg、0.2 ml/10 g劑量連續灌服7d柳氮磺胺吡啶藥物；小檗堿組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按15 mg/kg，0.2 ml/10 g劑量連續灌服7 d小檗堿；乳酸菌組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按33 mg/kg，0.2 ml/10 g劑量連續灌服7 d乳酸菌；枯草桿菌組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按30 mg/kg，0.2 ml/10 g劑量連續灌服7 d枯草桿菌；地衣芽孢桿菌組自由飲用3.5%DSS水溶液，每日同時間點按25 mg/kg，0.2 ml/10 g劑量連續灌服7 d地衣芽孢桿菌。

1.2.3疾病活動指數(DAI)評分 每日記錄小鼠體重，觀察腹瀉情況、大便性狀及便血狀況，參照評分系統〔15〕，進行疾病活動指數評估。

1.2.4ELISA檢測血清IL-17A表達水平 依照ELISA試劑盒說明書進行。

1.2.5結腸IL-6、IL-10、TNF-α水平含量測定 取0.2 g結腸，加入5 ml生理鹽水用勻漿器勻漿充分，然后以3 000 r/min離心10 min，收集上清液，檢測具體操作依照說明書進行。

1.2.6結腸形態觀察 取處死小鼠整段結腸，測量長度并做記錄，觀察各組小鼠結腸形態：黏膜是否光滑完整，有無糜爛、潰瘍、水腫等現象。

1.2.7結腸蘇木素-伊紅(HE)染色觀察 用預冷生理鹽水將結腸洗凈，于結腸末端(距肛門1 cm)處剪取0.5 cm長結腸，10%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片，采用HE染色法染色，光鏡下觀察。

1.3數據處理 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1DAI評分情況 飲用3.5%DSS溶液的各組小鼠第2天大便開始偏潤，活動量與飲水量均減少。隨實驗天數增加，模型組癥狀逐漸加劇，幾乎出現血便或隱血現象；7 d后各組腹瀉發生率、便血率均比模型組低，其中小檗堿組和乳酸菌組腹瀉發生率和便血率最低，地衣芽孢桿菌組介于之間。見表1；DAI評分結果見表2，與模型組比較用藥組均有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠腹瀉率、便血率(%)

2.2血清IL-17A測定結果 模型組血清IL-17A含量明顯高于使用各種藥物干預的治療組(P<0.05)。見表2。

2.3小鼠結腸組織IL-6、IL-10、TNF-α測定結果 柳氮磺胺吡啶組、小檗堿組、乳酸菌組、枯草桿菌組、地衣芽孢桿菌組的細胞因子IL-6、TNF-α含量較模型組均明顯下降(P<0.05)，而IL-10含量水平明顯上升(P<0.05)。 見表2。

表2 各組小鼠DAI評分、IL-17A水平、結腸長度及結腸組織IL-6、IL-10、TNF-α含量水平比較

2.4各組結腸形態、長度及病理觀察 圖1可見，對照組小鼠結腸黏膜完整、光滑，沒有出現糜爛或者潰瘍現象，沒有明顯損傷，而模型組損傷現象較嚴重，乳酸菌組、小檗堿組出現糜爛或潰瘍現象相對較少。模型組較其他組結腸更細，結腸中已無成形糞便；對照組結腸長度較其他組都長，且糞便成形，說明該批次小鼠無健康問題，柳氮磺胺吡啶組、小檗堿組、乳酸菌組、枯草桿菌組、地衣芽孢桿菌組結腸長度與模型組比較顯著更長(P<0.05)。 見表2。

圖2可見，對照組結腸黏膜完整、連續，無炎癥細胞和潰瘍形成；模型組結腸黏膜不完整，有潰瘍形成，腺體排列無序，隱窩缺失并出現大量炎性細胞；其他組經過藥物干預后炎性細胞相對減少，潰瘍嚴重程度降低，腺體破壞程度較輕，黏膜結構較完整，治療效果較好；其中乳酸菌、枯草桿菌、地衣芽孢桿菌組別結腸狀況與柳氮磺吡啶組狀況相仿，但優于小檗堿組。

圖1 用藥后各組結腸大體形態

圖2 各組結腸組織病理學形態(HE,×100)

3 討 論

UC病因可能與腸道微環境、飲食、遺傳、免疫等多重因素導致易感性機體對腸道黏膜抗原免疫應答失調有關，但其發病機制尚未完全清楚。根據炎性因子失衡是導致UC腸道炎癥發作的重要環節，腸道菌群失調亦會引起多種消化道炎癥性疾病〔16〕；莊鑫〔17〕通過調節患者免疫功能，控制炎性因子水平，抑制腸道炎癥，改善腸道菌群環境，減輕腸黏膜細胞損傷，改善腸道功能。本研究用不同的微生態制劑進行干預發現其對與UC的治療具有良好的效果。促炎因子與抗炎因子之間的平衡與UC的發病機制亦有關聯〔18〕。TNF-α由激活的單核巨噬細胞產生，在炎癥反應中促使其他細胞因子釋放，形成細胞因子網絡，擴大炎癥連鎖反應；IL-6由活化的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞分泌，能刺激巨噬細胞或單核細胞、淋巴細胞等合成前列腺素、細胞因子、血小板激活因子等炎性介質，是一種作用廣泛的促炎細胞因子〔19〕。IL-17A屬于促炎因子，由Th17細胞產生，能夠對UC的發生起調控作用〔20,21〕，隨著UC發病程度的加劇，IL-17A的含量持續增加〔22,23〕。UC病程發展，IL-6和TNF-α含量均隨著增高〔24,25〕。IL-10作為抗炎因子，由Th2細胞、單核-巨核細胞、B細胞分泌，研究表明IL-10含量水平的提高能有效減輕炎癥反應，益生菌或其代謝產物可能會通過促進IL-10表達，使其IL-10表達水平增高來達到治療UC的目的〔26,27〕。王旭霞等〔28〕研究發現，雙歧桿菌能經過抑制細胞因子分泌來降低腸道通透性從而對腸道黏膜起保護作用。黎莉等〔29〕研究發現降低TNF-α、IL-6含量能起到治療UC的作用，有助于結腸黏膜愈合。徐毅暉等〔30〕研究發現人促紅素能減少Th17分化生成IL-17A達到治療UC的目的。本研究顯示微生態制劑可以降低TNF-α、IL-6、IL-17A分泌水平，提高IL-10含量，并有助于維持腸黏膜上皮細胞的完整，保持腸黏膜屏障功能。