槲皮素改善慢性心力衰竭模型大鼠心功能的作用機制

張福宸 劉婧 賈偉佳 張麗敏 李大鵬 張桂霞

(佳木斯市中心醫院心內科，黑龍江 佳木斯 154002)

慢性心力衰竭是一種由心臟結構和(或)功能異常引起的導致心輸出量減少的臨床綜合征〔1〕。目前認為，慢性心力衰竭的主要原因包括心肌本身性疾病和心臟負荷過重性疾病，前者包括冠狀動脈硬化性心臟病、心肌梗死、心肌炎、擴張型心肌病等，后者包括高血壓、心臟瓣膜狹窄和關閉不全、慢性貧血和甲狀腺功能亢進等〔2，3〕。慢性心力衰竭在老年人群中的發病率較高，它會導致多器官受累和受損，常伴有呼吸困難、疲乏、液體潴留(如肺瘀血、體循環瘀血及外周水腫)和活動耐量下降等臨床表現〔4〕。心肌損傷、心臟結構發生不可逆性重塑、心臟舒縮功能異常及血流動力學紊亂是促使該病發展的推動因素〔5〕。近年來隨著醫療方法和手段的不斷更新，人類在心力衰竭治療中取得了長足的進步，但患者的主要健康轉歸，如住院率和健康相關生活質量等并沒有得到明顯的改善。根據最新的研究結果表明，23%～58%的慢性心力衰竭患者在1年后的隨訪中將會再次入院〔6〕。

槲皮素是一種來自于植物的黃酮類化合提取物，其分布廣泛，在高良姜、側柏葉、三七、桑寄生和款冬花等100多種藥用植物中均可被檢測到。作為一種重要的抗氧化制劑和免疫調節天然化合物，槲皮素具有預防和治療包括骨質疏松、癌癥、肺部和心血管等多種疾病的作用〔7〕。研究顯示，槲皮素的抗氧化作用與其能夠在體內和體外有效清除超氧陰離子、羥自由基(·OH)和單線態氧(1O2)等活性氧自由基、加強谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和總抗氧化能力(T-AOC)活性有關〔8，9〕。體內和體外實驗研究顯示，槲皮素可通過抑制炎癥細胞因子白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10、 IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、趨化因子CC配體(CCL)-8等的表達、通過不同信號轉導途徑如磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/核因子(NF)-κB和磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)/sirtuin(Sirt)1在急性痛風性關節炎、非酒精性脂肪性肝炎、血管炎和特應性皮炎等多種疾病中發揮抗炎作用〔10〕。此外，槲皮素被證實以劑量和時間依賴方式對肝癌、結腸癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、鼻咽癌、卵巢癌及乳腺癌等多種腫瘤細胞的增殖與侵襲具有顯著抑制作用，并誘導腫瘤細胞的凋亡〔11〕。本研究通過構建慢性心力衰竭大鼠模型來研究槲皮素對心力衰竭大鼠心功能紊亂的改善作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗用大鼠、試劑和儀器 SD雄性大鼠(北京維通利華)；戊巴比妥鈉(德國Sigma公司)；大鼠TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(中國博士德生物)；移液器(日本eppendorf 公司)；低溫冷凍離心機(德國Sigma公司)；全自動定量酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；便攜式彩色多普勒超聲心動儀(荷蘭Philips公司)；精密電子天平(日本AND公司)；離心管(美國corning公司)；高壓滅菌器(日本三洋公司)；大鼠灌胃器(北京冀諾泰科技發展有限公司)；血管鉗、止血鉗、手術刀、手術剪、手術鑷和縫合針(上海金粒醫療器械有限公司)；超低溫冰箱(日本三洋公司)；-20℃冰箱(青島海爾公司)；制冰機(廣東中冷制冰科技有限公司)；大鼠手術臺(上海玉研科學儀器有限公司)；小動物體重秤(美國雙杰公司)。

1.2實驗動物分組及模型制備 將購于北京維通利華的45只無特定病原體(SPF)級別的12周齡健康SD雄性大鼠(體重250～300 g)在空氣流通、環境溫度(23±2)℃、濕度適宜、相對安靜、光照/暗循環12 h的環境下以常規飼料適應性喂養1 w；將實驗動物隨機平均分為對照組、模型組和槲皮素組；各組按45 mg/kg行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉；常規手術區備皮和用75%酒精消毒后，用手術剪刀剪開皮膚、皮下組織、胸前肌肉和筋膜組織，剪開切口長度3～4 cm；用血管鉗沿第三肋間鈍性分離約3 cm長的肋間肌；打開胸腔及心包膜，并將結扎線在左心耳與肺動脈圓錐間穿過冠狀動脈左前降支；模型組和槲皮素組進行結扎，而對照組不結扎；結扎30 min后剪開結扎線，逐層進行關胸縫合肌肉和皮膚。

1.3模型的鑒定和給藥 手術4 w后，利用超聲心動儀檢測各組左室射血分數(LVEF)、左室舒張末期內徑(LVEDD)和左室收縮末期內徑(LVESD)，以LVEF<65%為模型制備成功；棄除不符合條件和死亡的大鼠后，槲皮素組連續每天灌胃給予槲皮素(100 mg/kg)，對照組和模型組則灌胃給予等量的生理鹽水，灌胃持續時間為8 w。

1.4一般生命體征觀察 每天按時觀察各組實驗大鼠的一般狀態，包括精神狀態、飲食、飲水狀況、皮毛色澤、反應靈敏度及活躍程度等。

1.5心功能指標檢測 在造模結束后4 w和治療結束后兩個時間點進行超聲心動儀檢測。檢測前各組禁食不禁水12 h，然后行戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，待用止血鉗夾捏四肢不發生夾捏發射后，將大鼠固定于檢測臺上，用電推剪剃掉大鼠胸前毛發，將涂抹耦合劑的超聲探頭放置大鼠胸前，設定參數來檢測各組LVEDD、LVESD和LVEF。

1.6血漿TNF-α水平檢測 用ELISA檢測各組TNF-α水平，具體操作如下：大鼠麻醉后抽取心室血；1 000 r/min離心15 min以收集血漿；向各孔中分別加入100 μl標準品和血漿樣本；37℃孵育90 min；向各孔中分別加入100 μl TNF-α抗體工作液；37℃孵育60 min后用洗滌緩沖液洗滌3次；向各孔中分別加入100 μl ABC工作液；37℃孵育30 min后用洗滌緩沖液洗滌5次；向各孔中分別加入90 μl TMB顯色液，37℃避光孵育15～20 min；向各孔中分別加入100 μl TMB終止液；酶標儀讀取450 nm處OD值；繪制標準曲線，計算樣本濃度。

1.7統計分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1一般狀況 灌胃給藥8 w后，對照組精神狀態良好、飲食、飲水正常、體重逐漸增加、皮毛光滑潤澤、反應靈敏、活動頻繁。模型組則精神狀態差、神色萎靡不振、攝食量減少，體型消瘦，皮毛枯萎無光并出現脫毛、反應遲鈍、倦怠懶動。槲皮素組上述一般狀態和表現較對照組較差，但強于模型組。

2.2心功能指標 手術4 w后，未進行灌胃給藥前，模型組和槲皮素組LVEF值顯著低于對照組(P<0.01)，LVEDD和LVESD值則顯著高于對照組(P<0.01)。模型組和槲皮素組LVEF、LVEDD和LVESD值無顯著差異，這說明慢性心力衰竭可致大鼠發生明顯的心功能紊亂。

灌胃8 w后，與對照組比較，模型組和槲皮素組LVEF值仍然顯著降低(P<0.01)，而LVEDD和LVESD值仍然顯著增高(P<0.01)。槲皮素組LVEF值顯著高于模型組(P<0.05)，LVEDD和LVESD顯著低于模型組(P<0.05)，這表明槲皮素對慢性心力衰竭大鼠的心功能紊亂具有一定的改善作用。見表1。

表1 各組心功能指標

2.3血漿TNF-α水平 用藥后，與對照組〔(27.61±3.64)ng/ml〕比較，模型組和槲皮素組TNF-α水平〔(48.07±4.61)、(42.90±3.91)ng/ml〕顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，槲皮素組TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

槲皮素又稱槲皮黃素或櫟精，是從水果、蔬菜等天然植物中提取出來的多羥基黃酮類化合物，具有多種生物活性和廣泛的藥物學作用，在抗氧化應激、清除自由基、抑制炎性反應、參與免疫應答、抗腫瘤、調節器官功能等方面發揮重要的作用〔12〕。研究表明，槲皮素在心血管疾病中亦具有一定的保護作用，飲食中的槲皮素與冠心病的長期死亡率之間存在顯著的負相關性〔13〕。此外，應用槲皮素可顯著降低自發性高血壓大鼠的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和心率，槲皮素還可增強內皮依賴性乙酰膽堿對離體主動脈的舒張作用，降低自發性高血壓大鼠24 h前列腺素F2α 的尿排泄量和血漿丙二醛水平，表明槲皮素可減輕和緩解自發性高血壓大鼠的血壓升高、心臟和腎臟肥大及功能性血管變化〔13〕。心臟成纖維細胞在心肌重塑和心肌纖維化過程中起關鍵作用，而心肌重塑和心肌纖維化最終將導致心力衰竭。Wang等〔14〕研究證實，槲皮素二水合物可明顯抑制成纖維細胞分化標志物Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達，降低由血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的心肌纖維化、心臟收縮功能障礙、心肌炎癥和心肌肥大，槲皮素二水合物對AngⅡ體外誘導的成纖維細胞增殖和分化亦具有抑制作用，提示槲皮素二水合物可能成為治療心肌纖維化的潛在臨床候選藥物。槲皮素在治療心肌缺血再灌注損傷中發揮重要作用，Liu等〔15〕研究表明槲皮素在體內和體外均可顯著改善心肌的氧化損傷和細胞凋亡，抑制心肌缺血再灌注損傷誘導的NF-κB途徑的激活。高膽固醇血癥是肥厚型心肌病發展的危險因素，在對載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠的一項研究表明，敲除ApoE基因會使小鼠出現高膽固醇血癥，與野生型小鼠比較，ApoE基因敲除小鼠的左室舒張末期后壁厚度和總左室質量明顯增加，而當口服低劑量槲皮素后可在顯著降低ApoE基因敲除小鼠血漿總膽固醇和極低密度脂蛋白的同時，還明顯降低其左室舒張末期后壁厚度和左室重量〔16〕。另一項在ApoE基因敲除小鼠的研究中發現，使用槲皮素24 w后，可明顯減少高脂飲食小鼠的動脈粥樣硬化斑塊面積，降低系統性氧化應激反應，阻斷煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活步驟，提示定期食用槲皮素對預防動脈粥樣硬化具有重要的作用〔17〕。

與本研結果一致的一項有關高水溶性槲皮素對LVEF降低的急性失代償性心力衰竭(ADHF)的療效和安全性臨床研究表明〔18〕，靜脈注射槲皮素安全可靠，不僅不會產生任何嚴重的不良事件，而且還有助于改善ADHF患者的左心室收縮功能，降低心力衰竭的臨床嚴重程度。TNF-α是評估慢性心力衰竭嚴重程度及療效的常用指標，陳白玉等〔19〕報道慢性心力衰竭患者血清TNF-α含量顯著升高，表現為心功能不全Ⅲ、Ⅳ級患者血清TNF-α含量明顯高于心功能不全Ⅰ和Ⅱ級患者。作為一種炎癥因子，TNF-α可使β-腎上腺素能受體分解，進而發揮負性肌力作用〔20〕。朱艷等〔20〕報道，TNF-α水平升高可使心肌和乳頭肌的肌力顯著降低，左室收縮能力隨之減弱，進而導致心肌重構和心室泵血功能下降，TNF-α的表達可對惡性、衰竭性等重癥心臟病癥的發生和演進有明顯的誘導作用。此外，TNF-α可經減少蛋白質合成、促進肌肉消耗等途徑使心力衰竭患者活動耐量顯著降低〔21〕。TNF-α還可誘導心肌細胞凋亡、誘使心室重塑，其表達上調可顯著提高患者再入院和主要終點事件的發生率〔22〕。

綜上，槲皮素對慢性心力衰竭大鼠心功能紊亂具有明顯改善作用，其作用可能是通過下調TNF-α介導的抑制炎癥反應來實現的。