石斛酚抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)機(jī)制

劉意 金湘東 賈寶輝 馬宇 許麗敏

(1鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450052；2鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院眼科；3鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科)

糖尿病(DM)是一種高糖引起的血管慢性病變代謝病，其臨床癥狀以并發(fā)癥為主，包括糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病腎病〔1,2〕。糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是世界失明人群的主要原因〔3,4〕，因此針對其高效低毒藥物的研發(fā)具有重要意義。石斛(Dendrobii Herba)是一種傳統(tǒng)的中草藥，具有悠久的抗DM臨床應(yīng)用歷史〔5〕，但關(guān)于石斛酚抗DM活性知之甚少。石斛或石斛酚具有抗細(xì)胞毒、抗轉(zhuǎn)移的保護(hù)作用〔6〕，但其在DM引起的視功能障礙中的作用及機(jī)制尚未有報(bào)道。AKT的一般途徑稱為磷酸肌醇-3-激酶-蛋白激酶(PI3K-PK)B/Akt途徑或PI3K/AKT/mTOR途徑，以其涉及的上游和下游蛋白命名〔7〕。本研究通過建立高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，觀察石斛酚治療對其凋亡、氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1材料 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HREC購自ATCC；EGM2-MV內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購自瑞士Lonza公司；石斛酚(批號：809AKR1B101)購自Prospec Tany Technogene Itd；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒均購自大連碧云天；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑盒購自北京索萊寶公司。胎牛血清、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶均購自美國Sellect公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒、ECL發(fā)光液、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 對照組：視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HREC用含有10%胎牛血清的EGM2-MV內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。模型組：參考陳泰弘等〔8〕的方法，建立視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。低劑量組：將模型組細(xì)胞進(jìn)行50 μg/ml石斛酚處理48 h；中劑量組：將模型組細(xì)胞進(jìn)行60 μg/ml石斛酚處理48 h；高劑量組：將模型組組細(xì)胞進(jìn)行70 μg/ml石斛酚處理48 h。

1.3MTT法檢測細(xì)胞活力 將1.2各組細(xì)胞制成混懸液，調(diào)整密度至104個/ml，然后接種至96孔板，取適量1.2各組細(xì)胞，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液上清，然后每孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩使結(jié)晶充分融解，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞活性與細(xì)胞OD值呈正比。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 用 500 μl 的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-/FITC避光反應(yīng)20 min后再加入5 μl PI避光反應(yīng)20 min，用300目銅篩過濾，最后在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀結(jié)束檢測。細(xì)胞凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品重復(fù)3次。

1.5Western印跡檢測細(xì)胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、酶切caspase-3、PI3K、p-AKT、T-AKT的蛋白表達(dá) 取適量對數(shù)生長期1.2各組細(xì)胞，RIPA裂解后用BCA進(jìn)行定量，變性離心后取上清進(jìn)行蛋白上樣。按照Western印跡實(shí)驗(yàn)常規(guī)操作流程進(jìn)行電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。Image J分析目的條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞中ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量 按照SOD試劑盒、GSH-PX測定試劑盒、MDA檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒要求分別檢測細(xì)胞上清液中ROS、MDA、SOD、GSH-Px的含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響 與對照組〔(100.00±0.27)%〕相比，模型組細(xì)胞活性〔(42.18±8.64)%〕顯著降低；與模型組相比，低、中、高劑量組細(xì)胞活性〔(65.60±6.73)%、(79.58±8.04)%、(59.69±9.17)%〕顯著升高，與低劑量組相比，中劑量組細(xì)胞活性顯著升高，與高劑量組相比，中劑量組細(xì)胞活性顯著升高(均P<0.05)。

2.2石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞早期凋亡率和總體凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.05)，與低劑量組相比，中劑量組均顯著降低，與高劑量組組相比，中劑量組均顯著降低(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 檢測視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

表1 石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

2.3石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡蛋白的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞中酶切caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.05)，與低劑量組相比，中劑量組顯著降低，與高劑量組相比，中劑量組顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

1～5：對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，下圖同圖2 caspase-3和酶切caspase-3蛋白表達(dá)

表2 石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡蛋白的影響

2.4石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞中ROS、MDA含量顯著升高，SOD、GSH-Px含量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組細(xì)胞中ROS、MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.05)，與低劑量組相比，中劑量組細(xì)胞中ROS、MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px含量顯著升高，與高劑量組相比，中劑量組細(xì)胞中ROS、MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.5石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞AKT信號通路的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，與模型組相比，低、中、高劑量組細(xì)胞中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，與低劑量組相比，中劑量組細(xì)胞中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)顯著升高，與中劑量組相比，高劑量組顯著降低(P<0.05)，各組T-AKT蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3，表4。

圖3 檢測視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞AKT信號通路蛋白

表4 石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞AKT信號通路的影響

3 討 論

細(xì)胞凋亡是維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動態(tài)平衡的基礎(chǔ)，其通過清除衰老和病變的細(xì)胞保證機(jī)體健康〔9,10〕。李雅嘉等〔11〕、徐萬里等〔12〕研究報(bào)道，石斛酚對高糖誘導(dǎo)下的視網(wǎng)膜細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞均具有明顯的抗凋亡功效。研究首先構(gòu)建了高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過石斛酚治療后發(fā)現(xiàn)，石斛酚可抑制高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及酶切caspase-3的蛋白表達(dá)，說明石斛酚對高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞確實(shí)存在抗凋亡作用，為石斛酚的功能機(jī)制研究提供參考依據(jù)。Yoo等〔13〕研究報(bào)道，石斛蘭中四種酚類化合物分別為4-羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸，且這四種酚類化合物對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生具有明顯的抑制作用，揭示石斛酚的抗炎活性。Li等〔14〕建立了DM小鼠模型，石斛酚可有效降低小鼠血糖、體重、低密度脂蛋白和膽固醇的水平并增加小鼠胰島素水平，改善小鼠脂肪肝和糖尿病腎病，深入研究顯示，石斛酚可降低MDA含量，增加內(nèi)容物的抗氧化能力，另外還有降低IL-6和TNF-α表達(dá)的抗炎作用，首次揭示了石斛酚改善小鼠DM及其并發(fā)癥的功能，其機(jī)制可能與石斛酚的抗炎、抗氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究結(jié)果表明，石斛酚可抑制高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中促炎因子的分泌，促進(jìn)抗炎因子的分泌，發(fā)揮明顯的抗炎作用，與Li等〔14〕研究結(jié)果一致，揭示了石斛酚在高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的抗炎作用及石斛酚在DM并發(fā)癥中的潛在治療價值。

AKT家族激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于AGC激酶的一般類別(蛋白質(zhì)的AMP/GMP激酶和PKC亞家族)，其在人類中具有518個成員，且哺乳動物Akt的結(jié)構(gòu)和功能高度保守〔15～19〕。 陳泰弘等〔7〕報(bào)道，在高糖低氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路得到明顯抑制，經(jīng)過銀杏內(nèi)酯B治療后該通路被異常激活，細(xì)胞的凋亡和炎性損傷能力被抑制。本研究結(jié)果說明AKT信號通路被明顯抑制，與陳泰弘等〔7〕研究結(jié)果相一致；深入研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)石斛酚治療的高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K、p-AKT的表達(dá)明顯升高，AKT信號通路再次得到激活，甚至活性恢復(fù)到正常細(xì)胞水平，說明石斛酚治療功能的作用機(jī)制與激活A(yù)KT信號通路密切相關(guān)。