染料木素在實驗性狼瘡性腎炎中的作用及機(jī)制

舒嶠 方衛(wèi)東 任稱發(fā)

(贛州市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，江西 贛州 341000)

狼瘡性腎炎(LN)是以補(bǔ)體大量激活，免疫復(fù)合物在腎小球內(nèi)沉積，腎小球增生和硬化，腎組織炎癥反應(yīng)為特點的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)所導(dǎo)致的腎損害〔1〕。LN是導(dǎo)致SLE患者終末期腎臟病的首要原因，盡管激素及免疫抑制劑能夠改善部分LN患者預(yù)后，但仍有大量的LN患者進(jìn)展為終末期腎病〔2〕，極大增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，影響患者生活質(zhì)量。現(xiàn)有研究表明免疫調(diào)節(jié)失衡是LN發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，腎內(nèi)炎性細(xì)胞和炎性因子的大量浸潤導(dǎo)致不可逆腎損害是LN的主要原因。因此，尋找調(diào)節(jié)自身免疫功能潛在方法，通過抑制炎癥反應(yīng)對于開發(fā)LN治療藥物至關(guān)重要。染料木素作為一種大豆異黃酮類植物雌激素，在腫瘤、糖尿病、心血管疾病中均能發(fā)揮作用，其中抗炎作用最為突出〔3〕。有研究顯示，染料木素通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)來改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的肝毒性〔4〕。Abron等〔5〕發(fā)現(xiàn)染料木素能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化及調(diào)控全身炎癥因子，從而改善結(jié)腸炎。染料木素通過抑制巨噬細(xì)胞核因子(NF)-κB的活化，改善脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)〔6〕。既往研究證實，NF-κB激活后，促進(jìn)腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β的表達(dá)與分泌，顯著促進(jìn)LN的發(fā)展〔6〕。鑒于染料木素有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能，且染料木素在LN中作用未見報道，因此，本研究擬通過MRL/lpr構(gòu)建LN小鼠模型，觀察染料木素對LN的影響并探討可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 本實驗所用一抗均來自Cell Signaling Technology(Beverly,MA USA)公司。染料木素(純度≥98%)購自上海融禾公司，ELISA試劑盒購自上海藍(lán)基生物公司，染色試劑盒由北京海德創(chuàng)業(yè)公司提供。

1.2方法

1.2.1動物及實驗分組 實驗動物均由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供。實驗遵守實驗動物規(guī)范條例。分為對照組：15只C57BL/6雌性小鼠，鹽水灌胃8 w；模型組： 15只純種MRL/lpr 雌性小鼠，鹽水灌胃8 w；治療組：15只純種MRL/lpr 雌性小鼠，染料木素灌胃100 mg/(kg·d)治療8 w〔7〕。

1.2.2尿蛋白檢測 根據(jù)BCA試劑盒檢測方法，通過代謝籠收集小鼠第10周、第12周、第14周、第16周和第18周尿液標(biāo)本，使用 BCA 蛋白濃度檢測試劑盒進(jìn)行。

1.2.3免疫球蛋白(Ig)G 沉積 通過免疫熒光觀察IgG在腎內(nèi)沉積情況。使用冰凍切片滴加 Alexa Fluor-546 標(biāo)記的 IgG 抗體，室溫避光孵育2 h。封片后拍照分析。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色 石蠟切片脫蠟后HE染色，觀察腎小球硬化、增生及炎癥細(xì)胞浸潤。

1.2.5ELISA檢測 收集小鼠腎臟組織及血清，根據(jù)ELISA試劑盒檢測方法，配置梯度標(biāo)準(zhǔn)品與檢測試劑，96孔板種加入樣品及對照品，每孔100 μl，一抗過夜孵育后加入辣根過氧化物酶(HRP)-Streptavidin工作液，室溫孵育后苯胺(TMB)顯色，最后加入終止液 50 μl，酶標(biāo)儀檢測分析各組血清及腎組織中抗ds-DNA、IL-1β、TNF-α尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)的含量。

1.2.6Western印跡 小鼠腎臟組織勻漿后提取蛋白。通過核蛋白提取試劑盒分離核蛋白。上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗〔IκB的磷酸化(p-IκB)、NF-κB、F4/80、趨化因子配體(CCL)2、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1〕。過夜孵育加入二抗后電化學(xué)發(fā)光劑(ECL)顯色，檢測并分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1尿蛋白測定 第10周、第12周、第14周模型組與治療組小鼠尿蛋白無明顯差異(P>0.05)，而第16周、第18周尿蛋白檢測結(jié)果顯示染料木素治療能夠明顯降低治療組尿蛋白含量(P<0.05)，而模型組尿蛋白含量呈時間依賴性升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組尿蛋白水平比較

2.2腎臟組織HE染色 經(jīng)過染料木素干預(yù)后，治療組小鼠腎臟腎小球硬化、增生及炎癥浸潤情況明顯緩解，而模型組較對照組相比上述腎小球病理改變明顯加重。見圖1。

圖1 各組腎臟組織病理學(xué)觀察(HE，×400)

2.3IgG沉積情況 模型組小鼠腎小球IgG的熒光強(qiáng)度(123.2±17.1)與對照組(21.2±0.1)相比明顯增加，說明模型組小鼠腎小球大量IgG免疫復(fù)合物沉積，而染料木素干預(yù)后治療組小鼠腎小球IgG熒光強(qiáng)度(54.5±7.4)較模型組明顯降低(P<0.05)，結(jié)果說明染料木素能夠降低免疫復(fù)合物在腎小球中的沉積。見圖2。

2.4血清抗ds-DNA、BUN、Cr水平 模型組較對照組ds-DNA、BUN、Cr水平明顯增加(P<0.05)，而染料木素干預(yù)降低治療組小鼠其血清抗ds-DNA、BUN、Cr水平，說明染料木素降低SLE所導(dǎo)致的腎損傷(P<0.05)。見表2。

圖2 各組腎小球IgG免疫熒光染色(×400)

表2 各組抗dsDNA、BUN、Cr水平比較

2.5染料木素影響NF-κB的激活 模型組細(xì)胞質(zhì)中p-IκB與對照組相比顯著增加，通過提取核蛋白進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)模型組相較于對照組NF-κB p65入核增加(P<0.05)，表示NF-κB活化在模型組中被顯著激活。治療組小鼠經(jīng)過染料木素干預(yù)后抑制了p-IκB，并且抑制了NF-κB p65的入核(P<0.05)，結(jié)果表明染料木素能夠通過抑制NF-κB的激活干預(yù)LN的發(fā)生發(fā)展過程。見圖3，表3。

圖3 p-IκB與NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)外的表達(dá)

表3 p-IκB 與NF-κB在細(xì)胞核內(nèi)外的表達(dá)

2.6染料木素對炎癥的影響 模型組與對照組小鼠相比，腎組織內(nèi)F4/80、CCL2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，進(jìn)而說明炎癥細(xì)胞及炎癥因子參與了LN的發(fā)生發(fā)展。而治療組抑制炎癥相關(guān)蛋白的增加(P<0.05)，提示染料木素抑制NLRP3的表達(dá)從而抑制了LN腎組織的炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子的產(chǎn)生。見圖4，表4。

圖4 炎性蛋白在腎組織中的表達(dá)

表4 炎性蛋白相對表達(dá)定量

2.7染料木素對炎癥因子TNF-α和IL-1β的影響 染料木素干預(yù)后能夠明顯抑制SLE小鼠腎組織及血清TNF-α和IL-1β的增高(P<0.05)。見表5。

表5 腎組織與血清TNF-α及IL-1β水平

3 討 論

LN是導(dǎo)致SLE患者腎衰竭的主要原因。雖然目前已開發(fā)出多種免疫抑制劑治療LN，但仍有部分患者進(jìn)展為終末期腎臟病，嚴(yán)重威脅了LN患者生命與健康〔8，9〕。目前研究認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)失衡是LN發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。蛋白尿是LN腎功能惡化早期表現(xiàn)，本研究結(jié)果說明染料木素能夠改善腎小球的結(jié)構(gòu)，恢復(fù)腎小球的功能，進(jìn)一步解釋染料木素降低LN導(dǎo)致的蛋白尿增加。

以往的研究顯示NF-κB的激活與LN免疫失衡密切相關(guān)〔10〕。NF-κB是關(guān)鍵的炎癥啟動因子，其激活有賴于IKKβ活性使IκB磷酸化，激活后NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)炎癥反應(yīng)。研究顯示通過使用在IKK選擇性抑制劑抑制NF-κB活性，能夠限制改善LN導(dǎo)致的腎損傷〔9〕。在腎小管損傷研究中發(fā)現(xiàn)，抑制NF-κB能明顯緩解缺氧誘導(dǎo)的大鼠腎小管損傷〔11〕。同時，泛素結(jié)合蛋白ABIN1能夠負(fù)向調(diào)節(jié)NF-κB的活化〔12〕。利用ABIN1無活性小鼠研究發(fā)現(xiàn)，失活后的ABIN1刺激NF-κB活化，進(jìn)而促進(jìn)LN進(jìn)展〔13〕。因此，NF-κB信號激活是LN發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，染料木素能夠顯著抑制IκB磷酸化，LN導(dǎo)致的NF-κB核轉(zhuǎn)位明顯被抑制，因此染料木素可能通過抑制NF-κB的活化減輕LN導(dǎo)致腎損傷。

既往研究顯示，NF-κB是炎癥小體NLRP3的上游分子，促進(jìn)NLRP3的激活從而介導(dǎo)LN的發(fā)生發(fā)展〔14〕。有文獻(xiàn)報道，通過抑制NLRP3在MRL/lpr小鼠中的表達(dá)，能夠減輕LN介導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)〔14〕。NLRP3作為Caspase-1的上游，能夠激活Caspase-1的活化。以往研究表明，通過敲除Caspase-1能夠抑制LN的活動進(jìn)展，并且抑制P2X7受體能夠顯著降低LN中NLRP3和Capase-1的表達(dá)，影響IL-1β的表達(dá)與活化，延緩LN腎功能惡化〔15〕。CCL2是巨噬細(xì)胞重要的炎癥趨化因子，促進(jìn)其在腎臟組織內(nèi)浸潤，巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子參與LN的發(fā)生發(fā)展過程〔16〕。本實驗發(fā)現(xiàn)染料木素能夠抑制Caspase-1的激活及IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生與釋放，同時能夠減低單核細(xì)胞趨化因子CCL2的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞在腎臟內(nèi)浸潤，減輕腎小球增生和硬化，達(dá)到保護(hù)LN腎功能的目的。染料木素抑制LN發(fā)展可能的機(jī)制是抑制NF-κB/NLRP3軸的激活，從而抑制LN腎內(nèi)的炎癥反應(yīng)，恢復(fù)腎臟內(nèi)免疫平衡，保護(hù)腎臟結(jié)構(gòu)和功能。