水熱預處理竹材制備低聚木糖和單糖的研究

詹云妮，黃 晨,，郝 昕，王梓萌，鄧擁軍,，房桂干,*

(1.中國林業科學研究院 林產化學工業研究所；生物質化學利用國家工程實驗室；國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室；江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.南京林業大學 江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京 210037)

隨著世界經濟的迅速發展，人們對資源的消耗和需求量不斷提高，由此引發的能源危機、資源短缺和環境問題受到越來越多的關注。因此，開發利用可再生能源逐漸成為研究的熱點[1-2]，而木質纖維素制備燃料乙醇則是可再生能源研究的重要方向之一[3]。酶解木質纖維制備燃料乙醇是較為常用的一種方法，原料中的木質素和半纖維素的存在阻礙了纖維素酶與纖維素的接觸。因此，為獲得較高的酶解效率，首先需要對木質纖維原料進行預處理[4-5]。在眾多的預處理方法中，水熱預處理由于清潔、高效及低成本等特點而受到學者們的青睞[6]。水熱預處理不需要額外添加任何化學試劑，環境負荷小，具有良好的發展前景[7-8]。同時，水熱預處理過程中木聚糖大量降解，且主要以低聚木糖(XOS)的形式存在于水解液中，因而也被廣泛應用于XOS的制備。大量研究已證實XOS是一類益生元，能夠有效增殖動物腸道內的有益菌群，促進動物健康[9]。王毓等[10]以龍竹為原料，采用微波輔助水熱處理制備XOS，在反應溫度為180 ℃時，XOS產率為31.4%，較單獨的水熱預處理產生的單糖和副產物更少。Zhang等[11]研究發現，甘蔗渣在200 ℃條件下自水解反應10 min，XOS產率為50.4%，引入乙酸輔助甘蔗渣自水解，XOS混合物的平均聚合度明顯降低，低聚合度XOS(聚合度2～5)的產量達到53.0%。竹材具有資源豐富、生長快、周期短等特點，且竹材的固碳量與生物量高于熱帶雨林植物，其作為生物質煉制技術的原料擁有巨大的發展潛力[6,12]。本研究以貴州慈竹為原料，考察了不同預處理強度下，竹材中的纖維素、半纖維素和木質素的物理和化學結構變化，探討預處理強度系數對酶解效果和XOS得率的影響，以期為竹材類生物質資源的高效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

慈竹由貴州赤天化紙業股份有限公司提供。竹材主要組成(以質量分數計)：葡聚糖44.5%、木聚糖15.8%、阿拉伯糖3.7%、木質素29.1%和苯醇抽提物5.9%。纖維素酶(諾維信CTec2)和木聚糖酶(諾維信c2753)，均購于Sigma-Aldrich(上海)公司，酶活力分別為250 FPU/g和174.5 U/g。

JWP50雙螺桿擠出機，江蘇金沃機械有限公司；GNM300盤磨，北京春暉機械有限公司；Advanced D8X射線衍射(XRD)儀、TENSOR27傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀，德國布魯克公司；Agilent 1260系列高效液相色譜(HPLC)儀、Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱、示差折光檢測器，美國安捷倫科技公司。

1.2 水熱預處理

竹片首先經自來水浸泡過夜，對浸泡后的竹片進行雙螺桿擠壓以破碎竹細胞，從而減小物料尺寸；經過雙螺桿擠壓的物料再次進行盤磨處理，磨盤間距為0.2 mm。經過處理的竹纖維尺寸約為1～2 mm。

竹材水熱預處理在甘油油浴中進行(含有10個1 L的反應罐)。將50 g絕干竹纖維置于反應罐中，按固液比1 ∶10(g ∶mL)加入去離子水。密封油浴罐，將其置于油浴中，之后按1 ℃/min升溫至180 ℃，并分別保溫20、40、60、80、100和140 min。預處理結束后，依次將反應罐取出，并迅速置于冷水中降至室溫。預處理物料和預水解液用濾袋分離，置于4 ℃冰箱中儲藏、備用。竹材水熱預處理時，溫度和時間對預處理的影響，最終都可通過預處理強度系數(lgR0)表示。不同預處理條件的lgR0，按式(1)計算：

(1)

式中：t—保溫時間，min；T—預處理溫度，℃；w—與預處理相關的活化能，取值14.75[13]。

1.3 纖維素酶水解

酶水解實驗在150 mL酶解瓶中進行，每批稱取2.5 g(以絕干物料計，下同)物料于150 mL酶解瓶中，加入1 mol/L 乙酸/乙酸鈉緩沖液2.5 mL調節體系pH值為4.8，然后分別加入纖維素酶25 FPU/g(以纖維素質量計，下同)、木聚糖酶174.5 U/g(以半纖維素質量計，下同)和適量去離子水，使反應體系體積為50 mL。將酶解瓶置于50 ℃和150 r/min的搖床中水解72 h。酶解結束后，水解產物于10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液測定其中的可發酵性糖(葡萄糖和木糖)濃度。預處理物料葡聚糖和木聚糖酶解率按式(2)和式(3)計算：

yc=m1×0.9/m2×100%

(2)

yh=m3×0.88/m4×100%

(3)

式中：yc—纖維素酶解率，%；m1—酶水解所得的葡萄糖質量，g；m2—預處理底物中纖維素(葡聚糖)質量，g；yh—半纖維素酶解率，%；m3—酶水解所得的木糖質量，g；m4—預處理底物中半纖維素(木聚糖)質量，g。

1.4 分析方法

1.4.1化學組分分析 葡聚糖、木聚糖、總木質素(酸溶木質素和酸不溶木質素之和)含量采用美國可再生能源實驗室(NREL)標準方法測定[14]。

1.4.2物料得率及化學組分回收率 物料得率和化學組分回收率按式(4)和式(5)計算：

y=m5/m6×100%

(4)

r=m7/m8×100%

(5)

式中：y—物料得率，%；m5—預處理物料質量，g；m6—初始物料質量，g；r—化學組分回收率，%；m7—預處理物料剩余組分質量，g；m8—初始物料中組分質量，g。

1.4.3單糖含量的測定 所有可發酵糖(葡萄糖和木糖)含量均采用Agilent 1260系列HPLC儀測定，進樣量10 μL，流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液、流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃。

實驗中低聚木糖(XOS)濃度采用酸水解法分析。首先離心除去預水解液中的不溶物，準確移取5 mL 離心上清液至酸水解瓶中，加入等體積的質量分數8%的H2SO4溶液，使體系酸質量分數為4%。混勻密封后，將酸水解瓶置于121 ℃下水解1 h，使體系中的XOS全部轉化為單糖。水解液中的XOS質量濃度和得率由酸水解前后水解液中木糖質量濃度的差值計算得出，公式見式(6)和式(7)：

c=(c2-c1)×0.88

(6)

yx=m9/m10×100%

(7)

式中：c—XOS質量濃度，g/L；c2—酸水解后木糖質量濃度，g/L；c1—酸水解前木糖質量濃度，g/L；yx—低聚木糖得率，%；m9—預處理液中低聚木糖的質量，g；m10—原料中木聚糖的質量，g。

1.4.4XRD分析 預處理樣品結晶度采用XRD儀測定，Cu Kα為發射源，入射線波長0.15 nm，配有Ni濾波片，測試過程中管壓40 kV，管流40 mA。X射線發生器功率為3 kW、新型9 kW轉靶，配有高速探測器D/tex-ultra。樣品的相對結晶度(ICr)根據Segal提出的經驗公式進行計算[15]，見式(8)：

(8)

式中：I002—002晶格的極大衍射強度；Iam—無定形區背景衍射的散射強度。

1.4.5FT-IR分析 稱取水熱預處理前后樣品10 mg，按質量比1 ∶100加入KBr(1 g)，混合均勻。在10 MPa下對樣品進行壓片后進行紅外分析，測試過程中，掃描波數范圍為400～4000 cm-1。

2 結果與分析

2.1 水熱預處理條件優化

2.1.1竹材化學組成及其回收率 竹材水熱預處理溫度為180 ℃，設置6個不同的預處理時間(20、40、60、80、100和140 min)，對應的預處理強度系數(lgR0)分別為3.66、3.96、4.13、4.26、4.36和4.50，未處理的竹材的強度系數為0。對原料竹材在不同預處理條件下進行水熱預處理，預處理強度對竹材化學組分質量分數和組分回收率的影響如表1和圖1所示。

從表1可以看出，預處理物料的葡聚糖、木聚糖及木質素質量分數均發生不同程度的變化。隨著預處理強度系數的增大，預處理物料得率逐漸從100%降低至41.7%，說明在預處理過程中，物料組分發生降解。當預處理強度系數從0增至4.50時，預處理物料中木聚糖質量分數從15.8%降低至3.5%，表明水熱預處理過程中，木聚糖大量降解；隨著木聚糖的降解，預處理物料中木質素的含量逐漸升高，木質素質量分數從29.1%上升到34.9%，葡聚糖質量分數先升高后降低，從44.5%上升到最大值59.7%再降低至55.5%，當預處理強度系數提高至4.50 時，預處理物料中葡聚糖質量分數僅為55.5%，相比強度系數為4.36時降低了4.2個百分點，表明在較高的預處理強度下葡聚糖也會發生降解。這與Moniz等[16]研究的水稻秸稈水熱預處理結果相一致，表明在水熱預處理過程中主要發生的是竹材木聚糖的脫除反應，同時保留了大部分葡聚糖和木質素。

表1 水熱預處理對竹材化學組分質量分數的影響Table 1 Effect of the LHWP on the mass fraction of the bamboo chemical components

由圖1可知，隨著預處理強度系數的增加，竹材中葡聚糖和木質素的回收率呈下降趨勢，而木聚糖脫除率逐漸升高。預處理強度系數為3.66時，竹材的木聚糖脫除率為54.6%；預處理強度系數增至3.96時，木聚糖脫除率增加了18.5個百分點，達到73.1%，該結果與表1中的結果相一致，表明水熱預處理中主要發生木聚糖的降解和溶解作用[17]。在水熱預處理高溫高壓條件下，竹材半纖維素側鏈的乙酰基發生脫落并與體系中的自由氫離子形成乙酸，增強了預處理反應體系的弱酸性環境，促進了物料的自水解[18-19]。當預處理強度系數超過3.96時，木聚糖的脫除率增幅變緩。

圖1 預處理強度系數對化學組成的影響Fig.1 Effect of pretreatment intensity coefficiency on chemical components

2.1.2酶解效果 預處理物料的酶解效率是評價預處理效率的關鍵因素，對未經處理和預處理的竹材進行酶水解，并分析酶水解得率與木聚糖脫除率之間的關系，結果如圖2所示。從圖可知，未經水熱預處理的竹材葡聚糖和木聚糖的酶解效率較低，分別僅為17.2%和27.2%。水熱預處理能夠顯著改善預處理竹材的酶水解效率，竹材葡聚糖和木聚糖酶解得率均隨著強度系數的增加而提高，當預處理強度系數從0增至4.50時，葡聚糖酶解得率從17.2%提高至79.0%，木聚糖酶解得率也從27.2%提高至92.0%。這是因為，隨著預處理強度系數的增加，預處理物料中木聚糖大量降解，物料化學結構被破壞，葡聚糖因此暴露出來，增加了纖維素酶對纖維素的可及性[20]，進而提高了預處理竹材的酶水解效率。為進一步明確木聚糖脫除對纖維素酶水解的影響，本研究探討了酶水解得率與木聚糖脫除率的關系(見圖3)。從圖中可以看出，葡聚糖和木聚糖酶水解得率與木聚糖脫除率之間有較強的線性關系，其R2分別為0.909和0.809，表明木聚糖的脫除確實能夠有效促進葡聚糖的酶水解。

圖2 預處理強度系數對酶解率的影響Fig.2 Effect of pretreatment intensity coefficiency on the enzymatic hydrolysis yield圖3 木聚糖脫除率與酶解率的關系Fig.3 The correlation between xylan removal and enzymatic hydrolysis yield

2.1.3低聚木糖(XOS)得率 水熱預處理過程中，大量木聚糖發生降解，并主要以低聚糖的形式存在于水解液中[21]，不同預處理體系中木聚糖降解產物XOS的濃度可見圖4。

圖4 預處理強度系數對XOS的影響Fig.4 Effect of pretreatment intensity coefficiency on the concentration of XOS

由圖4可知，水解液中XOS濃度隨著預處理強度系數的增加呈先上升后下降的趨勢。當強度系數為3.96 時，水解液中XOS質量濃度最高，為8.7 g/L(得率55.3%)。XOS是一類重要益生元，能夠有效促進動物腸道有益菌群的增長，進而有利于動物機體健康[22-23]，因此，XOS的高得率有助于實現竹材的高值化利用。當預處理強度系數超過3.96時，XOS濃度逐漸降低，在強度系數為4.50時，水解液中XOS質量濃度僅為0.5 g/L(得率3.1%)。這是因為隨著預處理強度的增加，半纖維素逐漸降解，并以XOS的形式存在；而當預處理強度系數較高時，水解液中的XOS會繼續降解，產生木糖、糠醛等物質，導致XOS濃度下降。

從圖4還可看出，隨著預處理強度系數的增大，木糖濃度呈先上升后下降的趨勢，當強度系數為4.26 時木糖質量濃度達到最大，為3.6 g/L。表明水熱預處理過程中，隨著預處理強度系數的增大，部分XOS會降解為木糖，而進一步提高強度系數，木糖也會分解。由此可知，水熱預處理是一種高效生產XOS的技術，然而結合2.2節酶解率最高的條件為lgR0=4.50，與XOS質量濃度最高的條件(lgR0=3.96)并不一致。因此，若利用水熱預處理對竹材進行加工，如何在保證XOS得率的前提下，提高預處理物料的酶水解效率將是今后研究的重點。

2.2 物料理化性質分析

2.2.1纖維素的結構變化 纖維素是由結晶區和非結晶區交錯聯結構成的，纖維素結晶區占纖維素整體的百分比稱為纖維素的結晶度，纖維素的結晶度是影響酶水解的重要因素之一[24-25]。為深入了解水熱預處理對竹材纖維素結構的影響，測定了不同預處理強度系數下，物料纖維素結晶度的變化，并分析了纖維素結晶度與酶水解得率的關系，如圖5和圖6所示。

從圖5可以看出，預處理后竹材纖維素結晶度呈增大趨勢，原料竹材(lgR0=0)的纖維素結晶度為55.2%。當預處理強度系數逐漸提高至3.96時，竹材結晶度逐漸從55.2%至63.1%，這是因為非結晶態的半纖維素和木質素的移除使得物料纖維素結晶度升高；繼續提高預處理強度系數，物料結晶度升高趨勢逐漸變緩，這可能由于在較高的預處理強度下，物料中結晶區纖維素也發生少量降解所致。

圖5 預處理強度系數對纖維素結晶度的影響Fig.5 Effect of pretreatment intensity coefficiency on the cellulose crystallinity

葡聚糖酶水解效率與纖維素結晶度的關系可見圖6。預處理竹材的酶解得率隨著結晶度的升高而升高，并且葡聚糖酶解率和結晶度間存在較強的線性關系，R2為0.807。通常認為纖維素結晶度越低，物料酶解率越高。這與Li等[26]對楊木水熱預處理的研究結論相似。在水熱預處理過程中，盡管預處理物料的纖維素結晶度升高，但是其木聚糖也大量降解，使得纖維素可及度增加，因而促進了纖維素酶對纖維素的水解。

圖6 纖維素結晶度與酶解率的關系Fig.6 Effect of the correlation between cellulose crystallinity and glucan hydrolysis yield

2.2.2紅外光譜分析 為進一步確認預處理過程中的組分變化，測定了不同預處理時間下竹材的紅外圖譜，結果如圖7所示。

圖7 竹材經不同預處理強度水熱處理后的紅外光譜圖Fig.7 FT-IR spectra of bamboo pretreated by LHWP with different pretreatment intensity

從圖7中可以看出，預處理前后樣品的紅外光譜圖類似，均保持著原料的特征，說明預處理前后竹纖維的主要結構沒有發生變化。根據FT-IR光譜確定產物的種類，與纖維素相關的特征峰在895 cm-1(糖苷鍵)、1034 cm-1(C—O—C伸縮振動)、2893 cm-1(C—H伸縮振動)和3331 cm-1(O—H伸縮振動)處。圖中1046 cm-1附近為C—H 芳香環面內振動；836 cm-1附近為木質素中C—H平面彎曲振動吸收，水熱預處理后該吸收峰減弱，可能原因是高溫使得部分木質素發生降解而溶出[27-29]。與原料相比，預處理后的竹材由于半纖維素部分降解以及脫乙酰基作用，1238 cm-1處的醚鍵吸收峰逐漸減弱，表明在水熱預處理過程中，竹纖維細胞壁中組分溶出或降解時存在醚鍵斷裂。在植物細胞壁組成中，木質素與周圍碳水化合物的鏈接方式包含芐基醚鍵和苯酯鍵[30]。這說明，在水熱預處理中，伴隨有木質素和碳水化合物的溶出，這與前述竹材水熱預處理后組分變化分析結果吻合。

3 結 論

3.1隨著水熱預處理強度系數的增加，半纖維素(木聚糖)含量逐漸降低，而纖維素(葡聚糖)和木質素含量逐漸升高，說明在水熱預處理過程中，主要發生的是木聚糖的降解。

3.2水熱預處理對酶解效果影響明顯，提高預處理強度系數(lgR0)可顯著提高酶解率。預處理強度4.5時，葡聚糖酶解率79.0%，木聚糖酶解率92.0%，酶解率均比未處理物料提高50個百分點左右。

3.3水熱預處理是一類高效制備低聚木糖的技術，低聚木糖濃度隨著預處理強度系數增加呈先上升后下降趨勢，并且在預處理強度系數(lgR0)為3.96時，低聚木糖質量濃度最高，為8.7 g/L(得率55.3%)；而纖維素酶水解效率最高的條件為lgR0=4.5。因此，如何在保證低聚木糖得率的前提下提高預處理物料的酶水解效率將是下一步研究的重點。