不同工藝對黃芩總黃酮提取率及其提取物性能的影響

朱溶月， 陳 媛， 李博莉， 解 甜， 王文蘋

（1.寧夏醫科大學藥學院，銀川 750004； 2.寧夏少數民族醫藥現代化教育部重點實驗室，銀川 750004）

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是由一定摩爾比的氫鍵受體和氫鍵供體組成的，熔點顯著低于其純組分的二元或多元混合物[1]。DES 被稱為“離子液體類似物”，但比離子液體性能更優越，不僅合成方法簡單，且低毒、價廉、生物相容性較佳。因此近年來DES 常作為新型“綠色溶劑”用于分離、合成、功能材料和電化學領域[2]，而其用于中藥有效成分提取和分離的研究正在興起[3]。

黃芩屬于常用大宗中藥材之一，其有效成分主要是以黃芩苷為代表的黃酮類成分，但這類成分水溶性差，因此，目前多采用乙醇回流提取[4]。黃芩提取物中黃酮類成分通常溶出緩慢、口服生物利用度較低[5]，對制劑研究提出了較高要求。本文采用最常見的DES 體系——氯化膽堿和乳酸提取黃芩黃酮類成分，并利用反溶劑沉淀法在分離溶劑的同時獲得提取物微粉，以期達到提高提取效率、改善提取物制劑特性的雙重目的。

1 試劑與儀器

1.1 試劑與藥品

黃芩飲片（1712151，寧夏明德中藥有限公司，經寧夏醫科大學藥學院教授鑒定）、黃芩苷（98%，141208，南京景竹生物科技有限公司）、氯化膽堿（20140810，上海瑞永生物科技有限公司）。二縮三乙二醇、十二烷基硫酸鈉、甘露醇、羥丙基甲基纖維素、泊洛沙姆188、聚乙烯吡咯酮、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為分析純，所用水為純化水。

1.2 儀器

FW135 中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）、DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市矛華儀器有限責任公司）、756PC 紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、Nano ZS90激光粒度儀（英國）、LSRH500 高速剪切機（常州勵岸寶機械設備科技有限公司）、FD-1C 冷凍干燥機（北京德天佑科技發展有限公司）、C715RE 臺式微量冷凍離心機（日本日立）、RCZ-8M 自動取樣溶出儀（天津市天大天發科技）、THZ-100 恒溫培養搖床（上海一恒科技儀器有限公司）、PL203 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、YS100 顯微鏡（南京凱爾儀器有限公司）、Milli-Q 型超純水處理系統（美國Millipore公司）。

2 方法和結果

2.1 黃芩總黃酮的含量測定

以蘆丁為對照品，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH為顯色體系，采用紫外-可見分光光度法于510 nm處測定吸光度，并依據標準曲線A=0.0133C～0.0207（r2=0.9989）計算濃度及含量[6]。

2.2 黃芩提取液的制備

2.2.1 DES 溫浸提取 將黃芩飲片粉碎過80 目篩，稱取50 g 黃芩粉末，加入500 mL 含20%水的DES（氯化膽堿與乳酸摩爾質量比為1∶2）[7]，70 ℃水浴恒溫攪拌30 min 后，經高速離心（12000 r·min-1，10 min），取上清液備用。

2.2.2 乙醇回流提取 取黃芩粉末10 g，加65%乙醇170 mL，70 ℃加熱回流2 h[8]，提取液高速離心（12000 r·min-1，10 min），取上清液保存備用。采用2.1 方法測定提取液中總黃酮含量，提取液呈棕黃色且DES 所得提取液色澤較深，DES溫浸和乙醇回流法測定計算得黃芩總黃酮提取率分別為（12.64±0.86）mg·g-1和（0.19±0.07）mg·g-1，二者相差約67 倍，表明DES 溫浸法對黃芩總黃酮提取效率優于乙醇回流法。見圖1。

圖1 不同方法所得黃芩提取液的外觀及總黃酮提取率

2.3 黃芩提取物納米混懸液及凍干粉的制備

采用反溶劑沉淀法，取10 mL 上述提取液，在高速剪切條件下（12000 r·min-1）加至100 mL 的HPMC 水溶液（5.3 mg·mL-1）中并持續剪切2 min，得到納米混懸液；高速離心（8000 r·min-1，5 min）后取沉淀，加少量水洗滌2 次，再加入適量水混懸，添加乳糖（5%，w/v）作為凍干保護劑混勻；先置于-80 ℃冰箱中預凍6 h，再經冷凍干燥48 h得凍干粉，密封保存備用。所得混懸液及凍干粉外觀均勻，其中DES 溫浸法所得樣品色黃，而乙醇回流法所得樣品色較淺。見圖2。

2.4 黃芩提取物凍干粉的初步評價

2.4.1 平均粒徑與粒徑分布 凍干粉（10 mg·mL-1）加適量水分散后，直接采用激光粒度儀分別測定樣品混懸液平均粒徑和多分散指數（polydispersity index，PDI）。經t 檢驗，乙醇回流提取物制得混懸液的平均粒徑遠低于DES 溫浸法（P 均＜0.05）。凍干粉復溶后平均粒徑和PDI 值較混懸液均增大（P 均＜0.05），但粉體平均粒徑仍小于1 μm。見表1。

圖2 不同方法制備黃芩提取物納米混懸液及凍干粉外觀

2.4.2 總黃酮含量 采用2.1 方法，分別取兩種提取物凍干粉10 mg 加30 mL 水復溶并測定總黃酮含量，結果DES 溫浸法和乙醇回流法所得樣品中總黃酮含量分別為（8.97±0.55）mg·g-1和（0.69±0.07）mg·g-1。

2.4.3 總黃酮飽和溶解度 分別稱取過量黃芩苷原料藥、黃芩提取物凍干粉置5 mL 離心管中，加水3 mL，在37 ℃、100 r·min-1條件下連續振蕩72 h，立即取出并高速離心（12000 r·min-1，5 min），取上清液加水適當稀釋，采用2.1 方法測定總黃酮含量并計算飽和溶解度。兩種提取物凍干粉中總黃酮溶解度均優于黃芩苷原料藥（P 均＜0.05），乙醇回流提取物高于DES 提取物（P＜0.05）。見圖3。

表1 黃芩提取物納米混懸液及其凍干粉的粒徑測定（±s）

表1 黃芩提取物納米混懸液及其凍干粉的粒徑測定（±s）

與同液體乙醇回流法比較*P＜0.05，**P＜0.01；與同方法混懸液比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

提取物制法 n 混懸液 凍干粉（復溶后）平均粒徑/nm PDI 平均粒徑/nm PDI DES 溫浸 3 421.77±22.11** 0.32±0.04* 950.17±46.75*▲▲ 0.54±0.01▲乙醇回流 3 53.91±0.34 0.16±0.01 486.27±55.80▲▲ 0.59±0.04▲▲?

圖3 黃芩苷及黃芩提取物凍干粉的飽和溶解度（n=3）

2.4.4 總黃酮體外溶出度 采用槳法進行體外溶出度實驗，分別稱取0.05 g 凍干粉及黃芩苷原料藥，加500 mL 水作為溶出介質，固定攪拌漿轉速為100 r·min-1、溫度為37 ℃。分別在1、3、5、10、20、30、45、60、90、120 min 取樣2.5 mL，迅速補充等量溫水，樣液經0.22 μm 微孔濾膜過濾，采用2.1 方法測定總黃酮含量并計算累積溶出度。如圖4 所示，黃芩苷原料藥2 h 時的累積溶出度不足30%；而兩種凍干粉中總黃酮則立即溶出超過50%，且在45 min 時累積溶出達90%以上。

圖4 黃芩苷原料及黃芩提取物凍干粉中總黃酮的體外溶出曲線

3 討論與結論

本文分別采用DES 溫浸和乙醇回流兩種方法提取黃芩中的總黃酮類成分，可觀察到所得提取液的外觀色澤差異顯著，并與總黃酮含量測定結果直接相關。由于提取物粒徑較小，屬亞微米級，因此兩種黃芩提取物中總黃酮的溶解度均顯著提高[9]。本文研究發現，乙醇提取物的溶解度稍高于DES 提取物，原因可能與其粒徑顯著較小有關。此外，兩種凍干粉的體外溶出行為差異很小，但兩種凍干粉中有效成分的溶出均優于黃芩苷原料藥，這與凍干粉粒徑小、有效成分溶解度高的特性直接相關[10]。

DES 可分為親水性和疏水性兩類[11]，目前常見的是以季銨鹽（如氯化膽堿）和羧酸（如乳酸）為代表的親水性DES，這類DES 能與水混溶、合成工藝簡便、生物相容性好，有利于對所得提取液進行后繼處理。現有研究[12-13]顯示，將親水性DES 用于提取植物中的黃酮、皂苷、多糖、蛋白質等多種成分，與傳統水、乙醇等溶劑相比，其有效成分提取率顯著提高。

黃芩中黃酮類成分的提取以水煎煮和乙醇（60%～70%）回流提取為主，間或輔以超聲、微波、紅外、酶解等技術改善提取效率[14-15]；其分離則以大孔吸附樹脂為主。李婷婷[7]以含水20%的氯化膽堿-乳酸（摩爾比1∶2）為溶劑，采用微波輔助提取黃芩中的4 種主要黃酮成分，并進一步通過ME-2 大孔樹脂進行富集。本文借鑒其優化后的提取工藝條件，并進一步將所得提取液直接與水混合，使得DES 與水混溶的同時難溶性黃酮類有效成分析出沉淀。DES 不僅提取效率優于傳統乙醇回流工藝，且所得提取物粉末溶解、溶出性能均較佳，有利于進一步制劑加工。

綜上所述，本研究采用DES 提取黃芩總黃酮并進一步經反溶劑沉淀法和冷凍干燥法制得黃芩提取物混懸液及其凍干粉，其粒徑小且較均勻。不僅提高了總黃酮提取率，也提高了在水中的飽和溶解度和溶出性能，優于傳統乙醇回流工藝。所得提取物可作為制劑中間體，便于進一步成型。本文為新型綠色溶劑用于中藥提取物的創新研究提供參考。