SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)多態(tài)性與腎結(jié)石相關(guān)性研究

游 攀， 馬 杰， 楊佳偉， 張 鶴， 徐冀東， 胡傳義

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院泌尿外科，上海 200135）

腎結(jié)石是泌尿外科的一種常見疾病。人群發(fā)病率為1%～5%[1-2]。我國(guó)南方地區(qū)是世界上三大結(jié)石高發(fā)區(qū)之一[3]。葡萄糖易化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9（SLC2A9）是調(diào)控腎小管中尿酸重吸收的重要因子。SLC2A9 基因的遺傳變異與人血清尿酸水平升高有關(guān)，其基因多態(tài)性在歐洲人群中可導(dǎo)致高尿酸血癥和泌尿系結(jié)石的發(fā)生，而歐洲人群與中國(guó)人群SLC2A9 基因型頻率有很大差異[4-5]，中國(guó)人群中是否存在SLC2A9 基因多態(tài)性與腎結(jié)石的相關(guān)性，此類相關(guān)報(bào)道較少。前期的研究[6]發(fā)現(xiàn)SLC2A9 基因多態(tài)性與腎結(jié)石的發(fā)生密切相關(guān)，為了解SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)多態(tài)性與腎結(jié)石形成之間的關(guān)聯(lián)性，本文對(duì)SLC2A9基因rs938552 位點(diǎn)多態(tài)性與生化指標(biāo)及結(jié)石成分的關(guān)系進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017 年1 月至2018 年12 月在上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院住院治療的高尿酸合并腎結(jié)石患者共300 例為病例組，其中男186 例，女114例，平均年齡（41.5±11.9）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2014 版泌尿外科疾病診療指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)臨床癥狀、尿路平片、B 超診斷為原發(fā)性腎結(jié)石；②華東地區(qū)出生、漢族、無異族通婚史、無血緣關(guān)系；③接受住院治療（經(jīng)皮腎鏡鈥激光碎石取石術(shù)、輸尿管軟鏡鈥激光碎石取石術(shù)、體外沖擊波碎石治療）；④無糖尿病、冠心病、高血壓病、腦梗塞、腦溢血等嚴(yán)重心腦血管疾病，能夠耐受治療；⑤有結(jié)石標(biāo)本并行結(jié)石成分分析；⑥簽署知情同意書并愿意接受相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者身體條件差，無法耐受治療；②患者文化程度低，無法理解知情同意書內(nèi)容，圍手術(shù)期無法配合治療；③排除因輸尿管梗阻及甲狀旁腺功能亢進(jìn)等因素導(dǎo)致的繼發(fā)性結(jié)石。另選取300 例上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院體檢中心的健康人群為對(duì)照組，其中男190 例，女110 例，平均年齡（42.4±12.3）歲，病例組及對(duì)照組均為出生于華東地區(qū)的漢族人群。本研究獲得浦東新區(qū)公利醫(yī)院倫理委員會(huì)的審議批準(zhǔn)及患者的書面同意。

1.2 試劑與引物

外周血DNA 分離試劑盒為BioTake 生物公司產(chǎn)品，PCR Master Mix 為MBI Fermentas 公司產(chǎn)品。SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)的引物序列按照DNA man 程序設(shè)計(jì)，上游5'-TACTGCTGAGGG CTGAGCA-3'；下游5'-CAAGGAGGGTGGATGGA-3'，由上海美吉生物科技有限公司合成。

1.3 PCR-Sanger 測(cè)序法分析SLC2A9 基因rs938552位點(diǎn)的基因型

1.3.1 DNA 的提取 采集空腹外周靜脈血4 mL，用外周血基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行分離提取。1.3.2 PCR 擴(kuò)增目的基因片段 SLC2A9 基因rs938552 分型反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括10 μL PCR Master Mix、上下游引物各30 pmol、0.1～0.5 μg DNA 模板。PCR 擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3.3 Sanger 測(cè)序 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用ABI 3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析，由上海美吉生物科技有限公司完成。

1.4 生化檢測(cè)

1.4.1 血生化檢測(cè) 采集早晨空腹外周靜脈血4 mL，1200 r·min-1離心15 min 后取血清，生化儀檢測(cè)血清尿酸、鈣、磷、鈉、鎂等水平。

1.4.2 24 h 尿液生化檢測(cè) 留取當(dāng)日晨8 點(diǎn)至次日晨8 點(diǎn)24 h 的全部尿液，混勻后精確測(cè)量并取尿液10 mL，采用高效液相色譜儀光電比色法測(cè)定尿生化指標(biāo)，包括尿液pH 值、尿酸、枸櫞酸、鈣、磷、鎂等。

1.5 結(jié)石成分分析

收集經(jīng)尿路排出或手術(shù)取出的結(jié)石標(biāo)本，去污、晾干，于70～100 ℃烘箱內(nèi)烘干。取約1 mg 結(jié)石粉末與溴化鉀按1∶200 的比例混合，研磨成粉。利用壓片機(jī)將以上混合細(xì)粉制成厚度約1 mm 的薄片。將薄片放入紅外光譜儀槽中掃描，繪制圖譜，自動(dòng)分析并報(bào)告結(jié)石成分[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Haploview 軟件對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行SNP Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，以此來確認(rèn)研究對(duì)象選取的隨機(jī)性。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)的比較用t 檢驗(yàn)。等位基因頻率及基因型頻率比較以及不同基因型間主要結(jié)石成分比較用χ2檢驗(yàn)。用比值比（OR）和95%的可信區(qū)間（95%CI）來評(píng)估腎結(jié)石與基因型的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)

對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行基因型Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)，結(jié)果顯示SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)的基因型期望值與觀察值吻合（P＞0.05），說明所選標(biāo)本可代表隨機(jī)婚配群體。見表1。

2.2 SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)基因分型結(jié)果

SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)有野生型（CC）、雜合型（CT）、突變型（TT）三種基因型。兩組SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)CC、CT 和TT 基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），兩組等位基因C、T 頻率差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表2。攜帶SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)雜合型及突變型（CT+TT）的人群其結(jié)石發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高于攜帶野生型（CC）的人群，前者發(fā)生結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)是后者的2.933 倍（OR=2.933，95%CI：1.632～5.264，P＜0.001）。

2.3 SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)基因型與血、尿生化指標(biāo)的關(guān)系

病例組攜帶SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)CC型與攜帶CT+TT 型者相比，前者血液尿酸和尿液尿酸、尿鈣低于后者（P 均＜0.05），而尿液pH值高于后者（P＜0.05），其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。見表3。

表1 SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)基因型分布Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)［例（%）］

表2 病例組及對(duì)照組SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較［例（%）］

2.4 病例組SLC2A9 基因rs938552 基因型與結(jié)石主要成分的關(guān)系

結(jié)石的化學(xué)成分有單純性與混合性。單純性結(jié)石以草酸鈣為主，混合性結(jié)石以草酸鈣/尿酸銨、草酸鈣/尿酸、磷酸鈣/磷酸鎂銨多見。結(jié)石的主要成分包括草酸鈣、尿酸、尿酸銨、磷酸鈣和磷酸鎂銨。攜帶SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)CC 型與CT+TT 型者比較，后者草酸鈣和尿酸的比例高于前者（P 均＜0.05）。見表4。

3 討論

在泌尿系結(jié)石的成因分析中，遺傳因素越來越受到人們的關(guān)注[8]。SLC2A9 是調(diào)控尿酸重吸收的重要因子，主要參與糖類代謝。SLC2A9 基因表達(dá)差異與尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性[9]，是血尿酸代謝最重要的調(diào)節(jié)因子[10]。Polasek 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，歐洲人群存在SLC2A9 基因SNP 位點(diǎn)多態(tài)性。國(guó)內(nèi)也有SLC2A9 基因多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道，尹逸叢[11]、張翻弟[12]等研究發(fā)現(xiàn)SLC2A9基因在我國(guó)西北人群中存在SNP 位點(diǎn)多態(tài)性，rs7442295 位點(diǎn)的多態(tài)性與低尿酸血癥相關(guān)；而rs2241480 位點(diǎn)的多態(tài)性與高尿酸血癥具有相關(guān)性。

尿酸又稱為2，6，8-三氧嘌呤，呈弱酸性，是人體內(nèi)嘌呤氧化分解代謝的終末產(chǎn)物，經(jīng)腎臟代謝途徑排出體外，包括腎小球?yàn)V過、腎小管重吸收、腎小管再分泌及分泌后再次重吸收。在調(diào)節(jié)血尿酸水平中，腎小管對(duì)尿酸的重吸收和分泌起著非常重要的作用。何群等[13]對(duì)191 例有完整血生化及24 h 尿分析結(jié)果的結(jié)石病患者進(jìn)行了系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)，高尿酸尿癥患者54 例，占28.3%，與國(guó)外的研究結(jié)果[14-15]一致。

本文對(duì)華東地區(qū)漢族人群300 例腎結(jié)石患者及300 例健康對(duì)照者進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SLC2A9基因rs938552 存在多態(tài)性，攜帶有CT 和TT 的人群患腎結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶CC 人群的2.933倍，雜合型和突變型患者血清和尿液中的尿酸均高于野生型，表明SLC2A9 基因rs938552 的變異與高尿酸血癥密切相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，雜合型和突變型患者與野生型比較，血鈣差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但尿鈣卻高于后者。攜帶有CT 和TT 人群的結(jié)石主要成分中，草酸鈣和尿酸的比例高于CC基因型。高尿酸血癥患者的尿液中尿酸量劇增，可形成尿酸結(jié)石并誘發(fā)含鈣結(jié)石[16-17]。因此，推測(cè)SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)的多態(tài)性可導(dǎo)致腎小球和腎小管對(duì)尿酸、鈣的濾過和重吸收出現(xiàn)異常，形成高尿酸血癥、高鈣尿癥，進(jìn)而導(dǎo)致腎結(jié)石的發(fā)生。對(duì)SLC2A9 基因的深入研究也許可以找到與腎結(jié)石相關(guān)的分子機(jī)制，為篩選今后作為治療的靶點(diǎn)基因提供依據(jù)。

表3 病例組SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)基因型與血、尿生化指標(biāo)的關(guān)系（±s）

表3 病例組SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)基因型與血、尿生化指標(biāo)的關(guān)系（±s）

生化指標(biāo) CC（n=239） CT+TT（n=61） t 值 P 值血生化指標(biāo)尿酸/（mm ol·L-1） 326.8±15.34 363.74±18.18 -16.143 0.006肌酐/（μmol·L-1） 86.29±12.77 82.58±11.14 2.076 0.096鈣/（mmol·L-1） 2.24±0.48 2.08±0.43 2.373 0.125磷/（mmol·L-1） 1.13±0.31 1.15±0.27 -0.461 0.339鉀/（mmol·L-1） 4.08±0.61 3.74±0.69 3.781 0.419鈉/（mmol·L-1） 141.43±3.81 142.56±4.07 -2.039 0.354鎂/（mmol·L-1） 0.98±0.09 0.95±0.11 2.216 0.261 24 h 尿生化指標(biāo)pH 值 6.85±0.79 5.69±0.61 10.679 0.013尿酸/mmol 3.61±0.49 4.17±0.53 -19.149 0.032草酸/mg 68.27±11.31 75.23±13.46 -4.121 0.087枸櫞酸/mg 349.26±43.14 313.25±37.18 6.433 0.341鈣/mg 6.42±0.75 7.35±0.85 -8.47 0.025磷/mmol 38.28±6.17 41.28±5.94 -3.415 0.163鉀/mmol 31.15±6.36 33.63±7.17 -2.647 0.573鈉/mmol 154.66±19.17 163.28±21.52 -3.056 0.821鎂/mmol 79.58±7.61 82.15±6.57 -2.417 0.078

表4 病例組SLC2A9 基因rs938552 位點(diǎn)基因型與結(jié)石主要成分的關(guān)系［例（%）］