iTRAQ 法分析孕期慢性應激子鼠腦海馬組織中蛋白質組學變化

付有娟， 關素珍， 趙 楓， 劉紅婭， 陳小惠， 戚發秋， 劉志宏

（1.寧夏醫科大學公共衛生與管理學院，銀川 750004； 2.寧夏環境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004）

孕婦在懷孕期間接觸工作壓力、家庭矛盾、經濟窘迫等生活應激事件，這些事件更易使母親產生焦慮、緊張、恐怖、抑郁情緒[1]，而且對子代的情緒行為、認知功能和神經內分泌產生不良影響[2-3]。如果母體妊娠期長時間接觸這種應激刺激，將導致子代注意力變弱，出現情緒和行為上的一系列問題[4]。腦海馬是與學習記憶能力高度相關的大腦邊緣系統[5]，它具有控制情緒、免疫和生殖等多方面的生理功能[6]。目前孕期慢性應激致子代腦海馬損傷相關疾病的研究大多就某一個蛋白或某一個信號通路，缺乏從整體角度對影響子代腦海馬損傷機制的系統研究，除了目前已知的蛋白和信號通路，是否還有其他信號通路參與調控尚不清楚。本研究采用iTRAQ 蛋白質組學技術高通量、高效率地鑒定及篩選孕期慢性應激子鼠腦海馬組織中差異蛋白的表達，并通過GO 功能注釋和KEGG 富集分析差異蛋白信號通路的情況，初步探討孕期慢性應激致子代腦海馬組織損傷的多種可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF 級未曾受孕的雌性SD 大鼠16 只，80～90 日齡，體質量（200±20）g；SPF 級雄性SD大鼠12 只，90～100 日齡，體質量（220±20）g。實驗動物購自寧夏醫科大學實驗動物中心，合格證編號為SCXK（寧）2015-0001。

1.2 實驗試劑與儀器

主要試劑：131I 皮質醇放射免疫試劑盒（北京北方生物技術研究所）、iTRAQ 8PLEX 試劑盒（AB Sciex）、三乙基碳酸氫銨緩沖液（triethylammonium bicarbonate buffer，TEAB，Sigma 公司）、Modified Trypsin 質譜級蛋白酶（PROMEGA 公司）。主要儀器：酶標儀softmax pro（Molecular Devices公司）、分析天平（Mettler Toledo 公司）、數顯式穩壓穩流電泳儀（上海天能科技有限公司）、超高效液相色譜儀（UPLC，Thermo Fisher Scientific 公司）、串聯質譜儀（Thermo Fisher Scientific 公司）、Q-Exactive Plus 質譜儀（Thermo）。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及模型建立 適應性飼養1周后，將雌鼠隨機分為對照組和模型組，每組各8只，模型組單籠飼養，對照組每籠3 只飼養；雄鼠隨機分為對照交配組4 只，模型交配組8 只，每籠3 只，均正常飼養。采用慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立孕期慢性應激大鼠模型[7]。應激方式包括24 h 擁擠環境（每籠8 只，籠具傾斜30°）；24 h 食物剝奪；24 h 水剝奪；24 h 潮濕環境（濕度60%～70%）；30 min 搖晃（1 次/s）；1 h 溫水游泳（31 ℃）；束縛應激30 min；5 min 熱應激（42 ℃）；1 min 夾尾（距尾尖1 cm 處）。以上9 種應激方式隨機分配到21 d 的應激實驗中，1 周內安排不同的應激方式，對照組母鼠不進行干預，正常環境飼養。

在應激開始前1 天、第1、7、14、21 天，對母鼠進行內眥靜脈采血，抗凝管收集后分離血漿，采用131I 皮質醇放射免疫試劑盒對血漿皮質醇含量進行測定，血漿皮質酮濃度=50×血漿皮質醇濃度[8]。在應激第3 天，模型組按雌雄1∶1 合籠，對照組按雌雄2∶1 合籠，合籠過程中應激刺激不間斷。次日檢查母鼠陰栓并觀察陰道涂片，確認受孕后將雌雄分籠，返回原飼養環境。應激刺激結束后，待所有母鼠分娩，根據各組母鼠的分娩只數及性別比例，從不同窩別中隨機抽取16 只子鼠（雌、雄各8 只），分為對照子鼠（prenatal control，PC）組與模型子鼠（prenatal stress，PS）組，雌雄分籠，每籠4 只，正常環境飼養。

1.3.2 大鼠海馬組織標本采集 待子鼠出生后52 d 時，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g，麻醉后，在冰上剝離大腦，海馬組織取出后用0.9%生理鹽水沖洗，裝于凍存管中，迅速放入液氮后轉移至-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.3.3 大鼠海馬組織蛋白制備 取海馬組織至振蕩管中，加入適量的蛋白裂解液（8M 尿素+1%SDS，含蛋白酶抑制劑），振蕩3 次，每次180 s，冰上裂解30 min，4 ℃，16000×g 離心30 min，取上清，BCA 蛋白定量。

1.3.4 蛋白酶解與iTRAQ 標記 每組取100 μg蛋白樣品，充分裂解，先加100 mM TEAB，再加10 mM 三（2-羧乙基）膦（TECP），37 ℃下反應60 min 后加入40 mM 碘乙酰胺室溫下避光反應40 min。加入預冷的丙酮，-20 ℃沉淀4 h 后，10000×g 離心20 min，取沉淀，加入100μL100mM TEAB 充分溶解樣品，按照 酶∶蛋 白=1 ∶50 加 入胰蛋白酶（Trypsin），37 ℃酶解過夜。胰蛋白酶消化后，用0.5 M TEAB 復溶肽段，iTRAQ 試劑中加入異丙醇，離心，每100 μg 多肽加入一管iTRAQ試劑，室溫孵育2 h 后加入50 μL 超純水，室溫30 min。根據iTRAQ 標記試劑盒標記樣品，PC 組標記為113，PS 組標記為115，將每組中等量標記產物混合裝于同一管中，真空濃縮儀抽干。

1.3.5 肽段組分離 用UPLC上樣緩沖液復溶后的多肽樣品，用反相C18 柱進行高pH 液相分離。緩沖液A 相為2%乙腈（氨水調至pH10），緩沖液B相為80%乙腈（氨水調至pH10），214 nm 波長進行檢測，200 μL·min-1流速。UPLC 洗脫梯度：0～17 min，0%～3.8%緩沖液B，17～34 min，3.8%～24%緩沖液B，34～37 min，24%～30%緩沖液B，37～38 min，30%～43%緩沖液B，38～39 min，43%～100%緩沖液B，39～47 min，100%～0%緩沖液B。根據峰型和時間將收取的20 個餾分合并成10個餾分，進行第二維分析。

1.3.6 肽段液相串聯質譜鑒定 使用C18 反相色譜柱（75 μm×25 cm，Thermo，USA）與溶劑A（2%乙腈、0.1%甲酸）、溶劑B（80%乙腈、0.1%甲酸）進行EASY-nLC 液相梯度洗脫：0～4 min，0～5%溶劑B，4～66 min，5%～23%溶劑B，66～80 min，23%～29%溶劑B，80～89 min，29%～38%溶劑B，89～91 min，38%～48%溶劑B，91～105 min，48%～100%溶劑B，105～120 min，100%～0%溶劑B。流速為300 nL·min-1。MS 掃描范圍（m/z）350～1300，采集模式DDA，選擇母離子中信號最強的20個（TOP20）進行二級碎裂，動態排除時間18 s。

1.3.7 蛋白質鑒定與定量 使用Thermo Xcalibur 4.0（Thermo，USA）軟件進行串聯質譜數據采集，采用Proteome Discoverer TM Software 2.2在NCBI 和UniProt 數據庫中進行蛋白的搜索與鑒定，用113、115 試劑報告離子的峰面積積分進行相對定量分析，以113 為對照子鼠組，按照115∶113 的比值，選取樣品中同一個蛋白的表達差異的倍數（fold change，FC）和統計學參數P 值作為參考標準進行兩組間差異蛋白的篩選，默認上調蛋白FC＞1.2，下調蛋白FC＜0.83，P＜0.05為差異有統計學意義。

1.3.8 生物信息學分析 利用GO 數據庫將Uniprot 數據庫分析鑒定出的差異蛋白，按照其亞細胞定位的細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）及生物過程（biological process，BP）三個方面進行功能注釋，采用KEGG 數據庫進行信號轉導通路分析，利用String 數據庫繪制差異蛋白進行蛋白互作網絡分析，分析蛋白之間的相互作用。

1.4 統計學方法

利用SPSS 23.0 統計軟件對母鼠血漿皮質酮含量進行分析，正態分布用均數±標準差（±s）進行統計描述，采用重復測量資料方差分析進行分析，檢驗水準α 取0.05，雙側檢驗。采用Goatools 軟件對差異蛋白集中的蛋白進行KEGG 富集分析，使用Fisher 確切概率法。為控制計算假陽性，默認選用BH（benjamini and hochberg）對P 值進行校正。

2 結果

2.1 孕期慢性應激母鼠血漿皮質酮含量變化

組間比較發現：模型組和對照組母鼠血漿皮質酮含量差異有統計學意義（F=7.717，P＜0.05），說明慢性應激對母鼠血漿皮質酮含量有影響；組內比較發現：時間因素對皮質酮水平的影響有統計學意義（F=6.076，P＜0.05），由圖1 可知，母鼠皮質酮水平隨應激時間的延長而變化，在應激第7、14 天，模型組皮質酮水平高于同期對照組（P均＜0.05），說明母鼠處于應激狀態。

圖1 孕期慢性應激對母鼠血漿皮質酮含量的影響

2.2 孕期慢性應激子鼠海馬組織的差異蛋白質鑒定

質譜分析結果顯示：模型子鼠組和對照子鼠組共篩選和鑒定出5065 個蛋白，差異蛋白有26 個（P＜0.05），其中上調蛋白19 個，下調蛋白7 個，見表1。差異蛋白火山圖與表達模式聚類圖均顯示這些差異蛋白在兩組中的表達差異有統計學意義，見圖2A、2B。

表1 孕期慢性應激子鼠腦海馬組織差異蛋白分析結果

圖2 孕期慢性應激子鼠腦海馬組織的差異蛋白鑒定

2.3 孕期慢性應激子鼠腦海馬組織差異蛋白GO 功能注釋

差異蛋白GO 功能注釋結果顯示：GO Term豐度前30 個結果。BP 主要涉及單有機體過程、細胞過程和生物調節等23 個方面；差異蛋白的CC 涉及14 個方面，主要包括細胞、細胞部分和細胞器等；所涉及的MF 主要有結合、催化活性和分子功能調節等9 個方面，見圖3。

2.4 孕期慢性應激子鼠腦海馬組織差異蛋白KEGG 富集分析結果

PS 與PC 的差異蛋白KEGG 富集分析結果顯示：共富集到57 條通路，其中顯著富集的信號通路有8 條（P＜0.05），見表2。

圖3 孕期慢性應激子鼠腦海馬組織差異蛋白GO 功能注釋統計圖

表2 孕期慢性應激子鼠腦海馬組織差異蛋白KEGG 富集分析結果

2.5 孕期慢性應激子鼠腦海馬組織差異蛋白互作網絡分析結果

將26 個差異蛋白新建蛋白集，利用String數據庫繪制差異蛋白功能互作網絡圖。其中String可識別的差異蛋白為18 個，主要包括INSR、MRPL18、PRSS1、PKG、CCK 等。α2A-AR、突觸小泡蛋白17、ε1 球蛋白等8 個差異蛋白未能識別，見圖4。

圖4 孕期慢性應激子鼠腦海馬組織差異蛋白互作網絡圖

3 討論

本研究采用CUMS 建立孕期慢性應激模型，升高的血漿皮質酮含量作為嚙齒類動物受到應激刺激的主要標志[9]。本實驗研究結果顯示：慢性應激第7、14 天，模型組母鼠血漿皮質酮水平高于對照組，提示孕期慢性應激模型建立成功，進一步展開對子鼠的研究。

通過iTRAQ 技術分析PS 和PC 腦海馬組織差異蛋白，上調蛋白19 個，下調蛋白7 個，這些差異蛋白涉及23 種BP、14 種CC 和9 種MF。BP主要涉及單有機體過程、細胞過程、生物調節、代謝過程等；CC 涉及細胞、細胞器、細胞膜及細胞外區等；MF 主要有結合、催化活性、分子功能調節和信號傳導功能等。

哺乳動物大腦的發育過程依賴于遺傳因素、環境因素和表觀遺傳之間的相互作用。胚胎期是大腦發育的關鍵時期，研究發現妊娠期母源性應激對胎兒腦海馬發育的影響最明顯[10]，機體通過重塑其結構和功能進而對子代的認知、行為和健康產生一系列長期乃至永久的影響。研究發現：孕期母體應激可誘導子代大腦回路產生長期的分子變化，如影響子代的多巴胺回路，增加成年子代發生神經精神疾病的風險[4]；孕期母體應激可致使子代下丘腦-垂體-腎上腺軸在易損期發生持久性或永久性改變，引起成年子代的認知功能障礙[11]；孕期慢性應激還會使N-甲基-D-天門冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)抑制mTOR 激活致使子鼠抑郁，甚至引起CA3 區神經元損傷[12]；在慢性應激母鼠的后代中，出現神經發育遲緩、行為及大腦標記物水平的改變[13]。總之，母鼠孕期慢性應激對子代腦海馬發育的影響，主要表現為體內多種生物大分子的改變，本研究分析發現子代腦海馬的變化主要涉及神經活性配體-受體相互作用、cGMPPKG 信號通路、胰腺分泌等信號通路。

孕期慢性應激子代腦海馬組織中有3 個差異蛋白參與了神經活性配體-受體相互作用通路，包括α2A-AR、CCK、PRSS1，均為上調差異蛋白。孕期慢性應激可引起子代焦慮、抑郁樣行為及認知功能下降，可能與多種神經遞質及受體有關。神經活性配體-受體相互作用信號通路涉及幾乎所有細胞質膜和細胞內外信號通路相關的受體及配體[14]。α2A-AR 是前額葉皮層中表達最豐富的腎上腺素能受體亞型[15]，其生理作用主要是反饋性抑制突觸前去甲腎上腺素釋放、降壓、鎮痛、鎮靜和催眠[16]。研究表明：α2A-AR 作為下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamus pituitary adrenal，HPA）軸中重要成員，在腦海馬中表達上調與抑郁患者自殺風險的增加高度相關[17]。CCK 是一類具有廣泛生物活性的腦腸肽，通過神經內分泌系統以多種方式作用，最后向中樞神經系統發出信號，引起機體作出反應[18]。CCK 作為胃腸道激素之一，以促進胰酶分泌與膽囊收縮為主要功能，在神經系統中也有廣泛分布[19]。Reich 等[20]在研究中發現，慢性應激可導致雄性大鼠體內CCK分泌異常，同時研究發現CCK 能促進周圍神經元損傷后的修復過程，主要通過外源性CCK 介導調節神經生長因子[21]。孕期應激會增加妊娠期間母體的胰腺炎、高脂血癥、子癇前期等疾病風險，進而使子代免疫功能降低[22]。此外差異蛋白CCK 和PRSS1 還參與了胰腺分泌的過程。除上述差異蛋白和信號通路外，cGMP-PKG 信號通路在子代腦海馬發育過程中也發揮了重要作用，3個上調差異蛋白參與了該信號通路的調節，分別是PKG、INSR 和α2A-AR。?lmestig 等[23]研究發現cGMP-PKG 信號通路參與神經發生和細胞增殖等過程。因此，推測該信號通路也參與了孕期慢性應激子代腦海馬的發育過程，涉及的具體作用機制需要進一步研究。

String 數據庫對蛋白互作網絡分析發現，這些差異蛋白位于多條信號通路的節點上，這些節點上的差異蛋白與所鑒定到的信號通路基本一致。母體孕期慢性應激對子代腦海馬發育的不良影響是多種蛋白質分子基于不同生物學途徑共同作用的結果。本研究基于iTRAQ 技術，從信號通路、蛋白質功能和蛋白互作網絡關系等多個層次來挖掘孕期慢性應激引起的子代海馬發育損傷的相關蛋白，其中CCK 和PRSS1、INSR、α2A-AR 可能是孕期慢性應激引起子代海馬發育損傷過程的重要靶點，將在后續研究中通過動物實驗加以驗證。