異常原料乳中一株芽胞桿菌的分離與鑒定

孫世浩潘姣姣高佳敏李蓮瑞

(1．塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

核糖體RNA是生物體蛋白質翻譯的重要組成部分。原核生物含有3種核糖體RNA(rRNA)分別是5S、16S、23S,5SrRNA的編碼基因(rDNA)最小，約為150bp，攜帶的遺傳信息較少；23SrRNA的編碼基因(rDNA)為3kb左右，數目過于龐大；16SrRNA基因長約1.5kb，而其中又分為可變區和穩定區2種，其中，可變區具有種間特異性，恒定區則差異很小，相比于酶基因其序列保守性高，并且核糖體RNA具有特殊性、重要性等特點，結構獨特并且相對保守，所以可以抵抗影響其結構的突變[1]，針對細菌種屬間16SrRNA基因存在的差異特征，可以對基因序列進行比對分析確定其進化關系，可以用于鑒別細菌。隨著測序技術逐漸成熟，細菌基因數據庫逐漸更新與完善，利用16SrRNA基因對菌株進行測序的分析技術逐漸成為細菌鑒定的一種重要方法[2]。張玲玲[3]研究了16SrRNA序列的測定對醫學微生物的鑒定所起的作用；郭成[4]研究了通過16SrRNA基因測序的方法確定了奶牛瘤胃細菌菌群受到低聚異麥芽糖后發生的變化；芮萍[5]完成了豬源奇異變形桿菌利用16SrRNA基因測序技術對基因序列的分析。這種方法時間需求短、準確性高，在微生物鑒定中逐漸流行。

貝萊斯芽胞桿菌能夠利用葡萄糖、糖原、乳糖、麥芽糖、蔗糖等糖類，產酸不產氣。貝萊斯芽胞桿菌能夠對血液、淀粉、明膠和酪蛋白進行水解，在沒有酵母提取物的培養基上貝萊斯芽胞桿菌也能夠生長。V-P試驗顯示該菌是發酵型[6]。利用16SrRNA鑒定菌株，通過數據庫比對確定其種屬，確定其是否會對生物制品品質產生影響，為進一步研究該細菌提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

原料乳，由南疆某乳制品企業提供保存備用，用于分離芽胞桿菌。

1.1.2 試劑

基因組提取試劑盒，凝膠回收試劑盒，PMD-19T，16SrRNA通用引物，溶菌酶，Tap DNA聚合酶。

1.2 試驗方法

1.2.1 異常原料奶中芽胞桿菌的篩選、分離、純化

在無菌操作臺上無菌操作將乳樣分裝到無菌的250mL錐形瓶中100mL。將取出的乳樣80℃水浴20min，水浴后的乳樣用無菌蒸餾水倍比稀釋5個梯度，然后用涂布法分別接種于錳鹽營養瓊脂、普通營養瓊脂和嗜冷菌計數瓊脂，倒置于恒溫培養箱培養。對培養出來的菌進行細菌菌落形態觀察，選取菌落形態不同的菌落，在對應的瓊脂上劃線，純化培養。純化后的細菌進行制片然后染色鏡檢，觀察菌體特征和芽胞染色情況，并記錄。選取有芽胞的，接種到無菌的液體培養基中，180rpm，37℃培養過夜，增加菌體濃度，用于DNA提取。

1.2.2 提取菌株的DNA

取1mL過夜培養后的細菌菌液加到無菌的離心管中，12000g離心1min，將上清部分去除，重復1次，收集適量細菌。

按照北京全式金生物技術有限公司DNA提取試劑盒(M10208)的說明書提取細菌的DNA。

1.2.3 菌株的16SrRNA擴增

利用通用的引物擴增芽胞桿菌16SrRNA的全長序列。

所用的引物序列為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR擴增的反應體系為1μL的DNA模板；1μL的上游引物和1μL的下游引物；25μL的EasyTaq Super Mix，加入ddH2O補至50μL。

PCR(聚合酶鏈式反應)反應條件為預變性：94℃，5min；變性：94℃，30S；退火：55℃，30S，延伸：72℃，90S；35個循環，72℃反應10min進行再次延伸。配置1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.4 菌株16SrRNA的克隆鑒定

對PCR產物切膠回收，然后分為2組，第1組按照16SrRNA片段0.5μL，pMD-19T Vector 3.5μL，Solution I 6μL的反應體系，連接16SrRNA與pMD-19T。第2組為pMD-19T載體自連，將16SrRNA片段換為ddH2O即可。將2組連接物分別加入10～100μL感受態克隆細胞DH5α中，放于冰水中混合30min，42℃熱沖擊90s，再置冰水中混合1min，加入800μL含有Amp加(50μg·mL-1)的LB液體培養基，于37℃的環境中，200rpm振蕩培養1h，取轉化菌100μL分別涂布于含有Amp加(50μg·mL-1)的瓊脂平板培養基上，培養12h，長出單菌落后，挑取單獨的菌落，放到含有Amp加(50μg·mL-1)的LB液體培養基中培養過夜。將2組分別提取質粒，將質粒進行電泳鑒定，然后以芽胞桿菌的16S rDNA克隆質粒為模板用通用引物進行PCR擴增，后經1%瓊脂糖電泳后，鑒定克隆質粒。

1.2.5 測序

對鑒定后的陽性克隆，提取質粒DNA后，送測序。

1.2.6 序列分析

測序所得的序列在NCBI上進行核苷酸序列比對，鑒定該芽胞桿菌的種屬。

2 結果分析

2.1 菌株的形態特征

由圖1可看出，該菌株屬于革蘭陽性菌，有芽胞產生，形狀為啞鈴狀，乳白色，邊緣較為粗糙。

圖1 菌株的形態特征

2.2 菌株的基因組、菌株的16SrRNA擴增、克隆、菌株及克隆質粒PCR的電泳結果

圖2中左上為菌株基因組的電泳結果，為基因組提取完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳得到的結果，結果顯示，只有1條明亮的條帶，大小約為在1500bp，說明該菌基因組被成功提取，后續試驗可以正常進行。

圖2中右上為菌株的16SrRNA擴增后的電泳結果，該芽胞桿菌使用細菌16SrRNA通用引物序列擴增后，使用細菌16SrRNA通用引物序列擴增出了該芽孢桿菌的16SrRNA的基因條帶大小約為1500bp，與預期大小一致，說明PCR擴增得到了16SrRNA基因序列。

圖2中左下為質粒PCR的鑒定結果(M∶DL-2000 Marker，1∶pMD-19T載體自連質粒電泳結果，2∶芽胞桿菌的16SrDNA克隆的質粒電泳結果)，pMD-19T質粒小，泳動速度快，在2000bp以下，pMD-19T細菌的16SrDNA質粒較大，泳動速度慢，在pMD-19T質粒之后，與預期大小一致。

圖2 菌株電泳結果圖

圖2中右下為菌株16SrRNA克隆質粒PCR結果，可看出克隆質粒PCR擴增出的基因大小約為1500bp，與目的基因大小相同，證明該克隆為陽性克隆，可以送測序。

2.3 菌株的16SrRNA的序列信息和比對結果

用通用引物測序所得到的基因序列去掉相關載體序列后，得到了菌株全長16SrRNA的序列信息。菌株的16SrRNA為1499bp，并將其提交至NCBI數據庫進行核酸比對，經由NCBI/blast比對后，用mega6.0軟件，根據 Neighbor-Joining法，并以Kimura2-parameter為模型，繪制基于菌株的16SrRNA全長序列的分子進化樹，進行1000次建樹自展。

由進化樹分析知，菌株與Bacillus velezensis strain Lac05D這種菌株親緣關系最近(如圖3所示)。

圖3 以NJ法繪制的菌株進化樹

3 討論

目前，微生物鑒定常用的方法有生化鑒定及分子生物學鑒定。生化鑒定出現較早，因其操作簡單被普遍使用，但生化鑒定也有其缺點，如耗時長、耗費大，當不同的微生物的生理與生化性質相似時不能夠進行準確分辨等；后來出現的全自動微生物鑒定系統的原理也是根據微生物的生化反應結果進行判定，因此需要先培養純化所需要鑒定的微生物，然后根據各種生化反應的結果與數據庫中的數據進行比對給予相應的判定結果，所花費的時間較長，而且目前該數據庫信息有限，無法將所有的微生物生化反應信息進行記錄，也只能對一些常見的微生物進行鑒定；而分子生物學的方法則更加迅速、精準，只需對微生物部分特異性較強的基因序列進行擴增，就可確定其微生物的種屬，時間所需較少，準確率也較高，因此被廣泛應用于各大領域。16SrRNA具有高度的保守性，使其可以被稱為細菌化石，通過對16SrRNA進行克隆，并測出基因序列，便可以對細菌的菌屬作出判斷。本次試驗通過對菌株的16SrRNA的PCR擴增，然后將測序結果與數據庫進行比對，對其種屬進行鑒定。本研究所用的引物為通用引物，特異性較弱，另外PCR反應過程中會出現假陽性，在擴增16SrRNA時很容易出現試驗誤差。因此，試驗過程中的各個步驟，如微生物的純化培養、挑取單克隆的操作、PCR反應的體系及PCR反應的條件，需進行嚴格控制以及反復摸索，為使16SrRNA能夠成功擴增，在試驗中設置了pMD-19T自連質粒的空白對照，使得利用16SrRNA序列分析結果的準確性得到保證[8]。

由蔡高磊等[9]撰寫的關于貝萊斯芽孢桿菌研究進展，具體描述了貝萊斯芽孢桿菌的菌落形態，本次試驗中菌株革蘭氏染色鏡檢結果和菌落形態結果符合，并且通過16SrRNA的鑒定及進化樹的分析也證明，菌株與Bacillus velezensis strain Lac05D同源性最高，可以確定菌株為“Operational Group B.amyloliquefaciens”分類單元的B.velezensis[10]。