烏頭內生細菌具有抑菌活性物質的理化性質研究

瑪依拉·吐爾地別克

(伊犁師范大學，新疆 伊寧 835000)

植物內生細菌是指能夠在健康植物組織內繁殖，且與宿主植物建立共生關系狀態的一類微生物，具有生物防治、植物促生長和內共生固氮等作用[1]。通常由于內生細菌與宿主植物存在長期的共生關系，從而造成這類細菌的種群結構及生物學功能不同于其土壤細菌和植物根際細菌，其中，可與宿主植物產生相同或相似的次生代謝產物為這部分內生菌的特點[2]。國內外研究發現，目前大部分藥用植物生長周期長，提取有效成分步驟繁瑣，生物藥學資源量較少，對于和植物產生共生關系的內生微生物的生長周期短，最重要的內生菌可產生與宿主植物相似的一些次級代謝產物，可以有效利用微生物來產生具有藥用價值的次級代謝產物，也可豐富生物資源[3]。作為中藥的烏頭類植物，具有良好的鎮痛抗炎、抗休克、擴張外周血管、抗氧化等作用。目前對于烏頭的研究報道常見于其藥效、有效藥用成分的提取、毒性、種植、田間管理和病蟲害的防治等[4]。綜上述研究可知，許多植物中的天然化合物與其內生菌具有密切聯系，甚至是內生細菌的次級代謝產物，這也就造成國內外學者陸續加強對植物內生菌的研究，由此發現植物內生細菌產生抗癌物質，為解決抗癌藥物的供應問題開辟一條新道路。從上述研究結果可知，烏頭的許多化學成分均具有抗腫瘤、抗菌和鎮痛等生物學活性，且表現廣泛，具有良好的開發潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用供試菌株YACX-1、YACX-2、YACX-3的3株菌株為具有抑菌活性內生細菌，指示菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)CGMCC1.1103株，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.769，均由伊犁師范大學生物與地理科學學院微生物實驗室保存。主要培養基為NB培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化

將實驗室所保藏的已分離、純化保存的3株內生細菌種接于NB固體培養基中，37℃培養，連續培養活化3代，并儲存于4℃冰箱備用。同時將作為指示菌的大腸桿菌、枯草芽胞桿菌的單菌落分別接種于LB培養基上，于37℃下培養，并儲放于4℃冰箱，備用于抑菌試驗。

1.2.2 具有抑菌活性內生細菌發酵液的制備

將活化好的3種菌株接種于NB液體培養基中培養后，8000r·min-1，20min，取上清液，置于4℃的冰箱中保存并使用。

1.2.3 不同發酵條件對抑菌活性物質的影響

在NB培養基上接種活化好的3種菌株，分別將溫度為28℃、37℃、42℃和pH設置為6.0、7.0、8.0，其中培養時間可分別設置成16h、24h，再離心收集上清液，用0.22μm過濾器過濾除菌，將100mL發酵液用旋轉蒸發儀濃縮至1mL后觀察抑菌圈大小。

1.2.4 不同熱處理和不同pH對菌株產抑菌物質抑菌活性的影響

吸取100μL供試菌菌懸液加入平板表面，用涂布器將菌液涂布均勻。在溫度和pH的處理中將具有抑菌活性烏頭內生細菌的3種菌株發酵液分別置于溫度45℃、60℃、80℃、100℃下熱處理10min，設置pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，過夜培養。之后即可采用紙片法對不同菌株設置2個重復，將紙片放入含有指示菌的待測培養皿中，放置于37℃下，過夜培養，并用游標卡尺測抑菌圈直徑并記錄。

2 結果與分析

2.1 具有抑菌活性烏頭內生細菌發酵液隨不同pH值、時間及溫度的變化情況

在3種菌株分別對2種指示菌的抑菌活性的檢測中由圖1至圖3中可知，YACX-1、YACX-2、YACX-3等3株菌株的發酵液在pH值為7，時間為16h時抑菌效果最佳。在最適pH和時間為基礎的情況下，可將溫度分別調節設為28℃、37℃、42℃時，可得出菌株的最適生長溫度為37℃。由此可表明，具有抑菌活性烏頭內生細菌最適生長條件為37℃，pH值為7，時間為16h。

圖1 28℃下3株具有抑菌活性烏頭內生細菌的抑菌活性

圖2 37℃下3株具有抑菌活性烏頭內生細菌的抑菌活性

圖3 42℃下3株具有抑菌活性烏頭內生細菌的抑菌活性

2.2 具有抑菌活性烏頭內生細菌對熱處理的穩定性

具有抑菌活性烏頭內生細菌經過不同的溫度處理時，其抑菌大小(mm)效果的變化如圖4可知，YACX-1、YACX-2、YACX-3所產抑菌物質在45℃抑菌效果最好，抑菌圈分別可達到8mm、10mm、9mm，在60℃、80℃和100℃，10min處理后有所降低。綜上所述，YACX-2菌株抑菌性耐高溫，故而在后期的內生細菌次生代謝產物中可有效利用并進行研究。

圖4 不同溫度下具有抑菌活性烏頭內生細菌抑菌活性穩定性檢測

2.3 具有抑菌活性烏頭內生細菌對pH穩定性

具有抑菌活性烏頭內生細菌對不同pH的穩定性如圖5所示，在pH值為4時，YACX-1、YACX-2和YACX-3均無生長；對大腸桿菌的抑菌效果從強到弱為，在pH值為5時，YACX-2>YACX-3>YACX-1；在pH值為6時，YACX-2、YACX-1>YACX-3；在pH值為7時，YACX-2>YACX-3>YACX-1；在pH值為8時，YACX-3>YACX-2>YACX-1。對枯草芽孢桿菌的抑菌效果從強到弱為，在pH值為5時，YACX-3>YACX-2>YACX-1；在pH值為6時，YACX-1、YACX-2>YACX-3；在pH值為7時，YACX-2>YACX-1>YACX-3；在pH值為8時，YACX-2>YACX-3>YACX-1。綜上述可知，具有抑菌活性烏頭內生細菌在酸性條件下不易生長，卻較為耐堿，這可為內生細菌的活性物質的研究打下基礎。

圖5 具有抑菌活性烏頭內生細菌對不同pH抑菌性的檢測

3 討論

在本試驗中，對具有抑菌活性烏頭內生細菌抑菌活性的最佳發酵條件的優化包括對溫度、pH、時間的研究。分別將培養溫度設為28℃、37℃、42℃，pH為6、7、8，培養時間為16h、24h的條件下采用紙片法測定抑菌圈的大小。結果可知，菌株的最適培養條件為37℃、pH值為7、時間為16h。在對于具有抑菌活性烏頭內生細菌的生物學特性研究中，其YACX-1菌株具有良好的熱穩定性，耐高溫，抑菌活性也較為穩定，而烏頭內生細菌在堿性條件下抑菌活性由強到弱依次為YACX-2>YACX-1>YACX-3。由此可知，烏頭內生菌耐堿、耐高溫，故而可在后期研究中有效利用烏頭內生細菌次級代謝產物，并用于藥用植物烏頭活性成分的分離提取與純化，這也恰恰表明了烏頭許多有效成分表現廣泛，具有較好的開發潛力，可為抗腫瘤、鎮痛和抗菌性等打下良好的基礎，且表明了烏頭內生細菌具有重要的開發價值，為尋找具有抗菌、耐高溫的活性次生代謝產物可有效利用提供參考依據。