接種根瘤菌對高效固氮植物合歡實生苗耐鎘性的影響

曾電源，張 芳，上官凌飛 ，周玉明，王永江，王彥杰，徐迎春*

（1.浙江偉達園林工程有限公司，浙江 杭州310051；2.南京農業大學園藝學院/農業農村部景觀農業重點實驗室,江蘇 南京210095；3.安徽蕪湖東源新農村開發股份有限公司博士后工作站，安徽 南陵241300）

目前土壤重金屬污染在世界范圍內十分普遍。鎘（Cd）因移動性大、毒性強、污染面積大被稱為“五毒（Cd、Hg、Pb、Cr、As）”之首[1]。因此，亟待對鎘污染的土壤進行修復。人工修復方法有物理修復、化學修復和生物修復。其中生物修復（包括植物和微生物）具有成本低、對環境影響小、最大限度降低污染物濃度、便于操作等優點。但實踐證明，單純植物或者微生物修復均存在一些不足之處。而近年來興起的微生物-植物聯合修復技術則是利用微生物-植物的共生關系，提高重金屬污染土壤的修復效率，展現出良好的應用前景，尤其是根瘤菌-豆科植物共生體系在重金屬污染土壤修復中占據了重要地位[2]。

在重金屬污染地，重金屬毒性和氮素不足是植物生長主要限制因子。根瘤菌-豆科植物共生體系是已知固氮能力最強的生物固氮體系之一，把豆科植物作為重金屬污染地的先鋒植物，利用根瘤菌－豆科植物共生體的固氮作用來加速污染地氮素積累，進而促進污染地的營養元素循環、積累和重金屬污染地植被恢復[3]；根瘤菌在促進植物生長的同時，還可通過長期的進化，有效適應環境的改變和有害物質的存在，表現出抗重金屬的能力。目前，已篩選出多種重金屬抗性根瘤菌[4]。同時根瘤菌還可刺激其他降解菌的生存和行動能力，從而降低污染物的濃度[5]。因此，利用根瘤菌-高效固氮植物進行重金屬污染土壤的改良是一個全新的思路，具有重要的現實意義。

園林植物不進入人的食物鏈，不存在食用安全的問題。因此，選擇具有經濟價值的豆科園林植物，利用其根瘤菌-植物共生體系，用于土壤重金屬污染治理，還可獲得較大的經濟效益，具有廣闊的發展前景。但目前關于高效固氮園林植物與根瘤菌共生對Cd 耐性的研究較少，限制了其在生態修復上的應用。

豆科喬木植物合歡（Albizia julibrissin Durazz）與根瘤菌共生，具有較強的固氮作用。合歡具有較大的經濟價值、觀賞價值和生態價值。在園林上適宜用作庭蔭樹、行道樹；其樹皮有安神解郁、活血止痛、驅蟲等功效；花可解郁寧心、開胃利氣；其嫩葉富含維生素C，為佐餐之佳品；其木材可作家具、建筑等[6]。

Sm1021 根瘤菌（Sinorhizobium meliloti 中華根瘤菌1021）是目前普遍使用的一類內生根瘤菌，可用于豆科植物和非豆科植物的接種，已被證明具有提高植物抗逆性的作用。但其能否提高合歡對Cd的耐性尚缺乏研究。

為此，本研究以合歡實生苗為試材,設置接種Sm1021 根瘤菌與不接種組，并進行不同濃度CdCl2處理，通過研究其對合歡幼苗生長發育和生理生化特性的影響，以驗證根瘤菌能否提高合歡對Cd 的耐性，以及根瘤菌緩解Cd 毒害的作用范圍，為外源接種根瘤菌提高合歡對鎘污染土壤的修復能力提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

將合歡種子首先用0.1%高錳酸鉀液浸泡2 h進行消毒，然后用100℃的開水進行燙種，不斷攪拌5 min，再加入適量冷水,使水溫達到40℃，浸泡一晝夜撈出，放入培養箱中黑暗條件下催芽，溫度白天30℃（8 h），夜晚20℃（16 h）。每天翻動1～2 次，適量加水，保持原有濕度。合歡種子催芽后播入50 孔的穴盤內（穴孔直徑6 cm，深12 cm）,基質采用泥炭：珍珠巖=3：1。

GFP 熒光蛋白標記的Sm1021 根瘤菌菌液由中國科學院植物研究所沈世華研究員贈送，為內生菌類型。

1.2 試驗處理

1.2.1 Sm1021 根瘤菌的培養與接種

①Sm1021 根瘤菌的培養方法（參照中國科學院植物所沈世華實驗室的方法）

培養液的成分：磷酸緩沖液（PBS）（NaCl 8 g、KCl 0.2 g、NaH2PO41.44 g、KH2PO40.24 g,調pH 至7.4，高壓滅菌）；四環素（Tc）（取100 mg，溶于10 mL無菌水中，過濾滅菌，用1.5 mL 離心管裝1 mL，4℃保存）；鏈霉素（Str）（取500 mg，溶于10 mL 無菌水中，過濾滅菌，用1.5 mL 離心管裝1 mL，4℃保存）；TY 培養基（1L）（蛋白胨5.0 g，酵母提取物3.0 g，CaCl2·2H2O 0.88 g，pH=7.4，高壓滅菌）。

培養方法：取100 mL 液體TY 培養基裝入300 mL三角瓶中，再分別加入下列貯備物：Sm1021-20℃保存的菌液100 μL；Tc（10 mg·mL-1）100 μL；Str（50 mg·mL-1）100 μL.置于28℃搖床、轉速為180×g，黑暗條件培養48 h，至OD600=0.8 時止。

菌體收集與洗滌：將培養菌液轉入100 mL 離心管，在室溫條件、4000×g 離心5 min,去上清；用PBS 重懸菌體，同樣條件離心，去上清；重復洗滌2次，再用無菌水將菌體稀釋至108 cell·mL-1備用。

②接種根瘤菌

每株幼苗接種1 mL Sm1021 根瘤菌活菌菌液，用移液器小心注入到幼苗根際約1 cm 深土壤表面。

③Sm1021 根瘤菌的檢測

接種后2 周，取4 株接種的合歡幼苗，在南京農業大學園藝學院中心實驗室，使用體式熒光顯微鏡（M165FC，Leica，德國）觀察合歡幼苗根部及葉片等部位的Sm1021 根瘤菌所標記的GFP 蛋白的定位情況，分析根瘤菌是否接種成功。將合歡幼苗的根尖切成5 mm 左右的小段；將葉片的下表皮撕下來，分別放于熒光顯微鏡下觀察，并拍照。

1.2.2 Cd 處理

待確定接種組接種成功后，將合歡幼苗分為7組（如表1所示）：不接種根瘤菌，不進行Cd 處理，作為對照，編號為CK；接種根瘤菌，不進行Cd 處理，編號為CK*；接種根瘤菌，同時分別設置5、10、15、25 mg·L-14 個不同濃度的CdCl2處理，編號分別為5 Cd*、10 Cd*、15 Cd*、25 Cd*；不接種根瘤菌，只進行25 mg·L-1CdCl2處理，編號為25 Cd。

表1 合歡實生苗試驗處理及其編號

每個處理15 株,分為3 組,每組5 株，視為重復3 次。Cd 處理組每3 天澆1 次設定濃度的CdCl2溶液，共重復澆灌5 次。待植株出現Cd 中毒癥狀后，采集葉片或根系鮮樣用于測定生理生化指標。

1.3 測定內容與方法

測定各處理合歡葉片的相對電導率、葉綠素含量、可溶性蛋白質含量、丙二醛（MDA）含量、SOD 活性。

相對電導率的測定參考 《植物生理學實驗指導》[7]的實驗方法來測定；葉綠素含量參考《植物生理學實驗指導》[7]的方法，采用95%y 乙醇提取，分光光度法測定；可溶性蛋白質含量的測定參考《植物生理學實驗教程》[8]的方法，采用紫外吸收法測定；丙二醛（MDA）含量的測定參考《植物生理學實驗》[9]的方法，采用TBA 法測定；SOD 活性測定參考《植物生理生化實驗原理和技術》[10]的方法，采用NBT 法測定。

1.4 數據分析方法

采用Microsoft Excel 2017 進行圖表繪制；采用SPSS 26.0 對試驗數據進行單因素方差分析(oneway ANOVA)，采用Duncan's 新復極差法進行差異顯著性分析，其中顯著性水平為p＜0.05，柱形圖標注的不同小寫字母表示其在0.05 水平上差異顯著。

2 結果與分析

2.1 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡幼苗生長發育的影響

從圖1可以看出，成功接種根瘤菌的對照組（CK）的合歡植株（圖1B）明顯比未接種根瘤菌的對照組植株（CK*）（圖1A）生長狀態好，表現為葉片數增加、株高增加，根系發達，尤其是側根數增加、根莖加粗。Cd 脅迫處理合歡（圖1C）的根系生長受到抑制，側根數明顯減少，葉片變小，葉片數減少；而Cd 脅迫處理接種根瘤菌后合歡（圖1D）的根系明顯較未接種組發達，雖然仍較對照組根系差，但仍有部分側根存活，且株高生長仍能維持較好的水平，葉片數也較未接種組高。說明接種Sm1021 根瘤菌后可使合歡在鎘脅迫下維持較正常的生長，緩解鎘的傷害。

圖1 接種Sm1021 根瘤菌對鎘脅迫下合歡幼苗生長發育的影響

2.2 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡葉片和根系相對電導率的影響

如圖2所示，接種根瘤菌的對照CK* 合歡幼苗葉片的相對電導率比未接種的對照組顯著降低，說明根瘤菌與合歡共生有利于保護合歡的細胞電解質外滲。接種根瘤菌后，低濃度（5 mg·L-1）Cd 脅迫下合歡葉片相對電導率與CK 并未顯著升高，說明根瘤菌可顯著改善合歡對低濃度Cd 的耐性；隨著Cd 濃度升高，葉片相對電導率也隨之升高，至15 mg·L-1Cd 處理時達到最高點，即使Cd 濃度繼續升高至25 mg·L-1，葉片的相對電導率也不再升高。高濃度（25 mg·L-1）Cd 處理下，接種根瘤菌后葉片的相對電導率較同濃度Cd 處理未接種根瘤菌組并未顯著降低，說明根瘤菌對高濃度Cd 脅迫下合歡葉片的細胞膜保護作用有限。

圖2 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉片相對電導率的影響

從圖3可以看出，CK*根系的相對電導率與CK無顯著差異，說明接種根瘤菌對于根系相對電導率無顯著影響。接種根瘤菌后，各處理濃度Cd 脅迫均導致根系的相對電導率顯著升高；且隨著Cd 濃度升高而隨之升高，至15 mg·L-1Cd 處理時達到最高點，即使Cd 濃度繼續升高（25 mg·L-1），根系的相對電導率不再升高。高濃度Cd 處理下，接種根瘤菌后根系的相對電導率較同濃度Cd 處理未接種根瘤菌組并未顯著降低，說明根瘤菌對高濃度Cd 脅迫下合歡根系細胞膜的保護作用有限。

圖3 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下根系相對電導率的影響

2.3 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡葉片MDA 含量的影響

由圖4可以看出，CK* 組葉片的MDA 含量比CK 組顯著降低，說明接種根瘤菌可保護膜系統的過氧化。接種根瘤菌后，低濃度（5 mg·L-1）Cd 脅迫不會導致MDA 含量升高；但隨著Cd 處理濃度升高，葉片MDA 含量仍然逐漸升高。與未接種根瘤菌的高濃度（25mg·L-1）Cd2+處理相比，接種根瘤菌的合歡MDA 含量并無顯著降低，說明根瘤菌在高濃度下難以發揮對細胞膜的保護作用。

圖4 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉片MDA 含量的影響

2.4 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡葉綠素含量的影響

如圖5所示，接種根瘤菌的對照組（CK*）合歡幼苗的葉綠素含量比未接種的對照組（CK）顯著升高，說明根瘤菌可促進葉綠素的合成。

圖5 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉綠素含量的影響

5-15 mg·L-1Cd 處理下，合歡的葉綠素含量與CK 相比，并未顯著降低，說明根瘤菌可保護葉綠素不受Cd 毒害，直到高濃度（25 mg·L-1）Cd 處理下，葉綠素含量才顯著下降。接種根瘤菌的植株在高濃度Cd 處理下葉綠素含量與未接種組并無顯著差異，說明在高濃度Cd 脅迫下，根瘤菌無法發揮緩解葉綠素受Cd 毒害的作用。

2.5 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡可溶性蛋白質含量的影響

從圖6可看出，接種根瘤菌的對照組（CK*）合歡葉片可溶性蛋白質含量比未接種的對照組（CK）高，說明根瘤菌共生對提高可溶性蛋白質含量有一定的積極作用。

圖6 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉片可溶性蛋白質含量的影響

各濃度Cd 處理均導致接種根瘤菌的合歡葉片可溶性蛋白質含量顯著下降，且隨著Cd 濃度的升高而逐次降低。但在高濃度（25mg·L-1）Cd 脅迫下，接種根瘤菌的植株蛋白質含量較未接種組顯著升高，說明根瘤菌共生可顯著緩解合歡受Cd 毒害導致的可溶性蛋白質含量下降。

2.6 接種根瘤菌對鎘脅迫下合歡葉片SOD 活性的影響

如圖7所示，接種根瘤菌的對照組（CK*）葉片的SOD 活性比未接種對照組的顯著降低，說明根瘤菌可增強合歡幼苗清除氧離子自由基的能力。接種根瘤菌后，較低濃度（5-15 mg·L-1）的Cd2+處理導致合歡葉片SOD 活性顯著上升，且呈現出隨Cd 濃度升高而升高的趨勢。說明根瘤菌可以激發合歡的抗氧化酶系統緩解Cd 脅迫導致的氧化傷害。

圖7 接種根瘤菌對合歡在Cd 脅迫下葉片SOD 活性的影響

高濃度（25 mg·L-1）Cd2+處理導致葉片SOD 活性較對照顯著降低，但接種根瘤菌可使SOD 活性有一定程度的恢復，但仍然無法恢復到對照水平。說明根瘤菌只能在一定程度上抵御Cd 脅迫；其清除氧離子自由基的能力有限,超過此濃度（15 mg·L-1）后，Cd 脅迫對膜的傷害程度超過了保護酶的防御能力,合歡體內的SOD 活性下降。

3 討論

已知根瘤菌與豆科植物共生，可顯著促進植物生長。本研究也證實了這一點。接種根瘤菌后，豆科植物合歡的實生苗根系較未接種組發達，葉片數、株高均增加。而且接種根瘤菌的對照組（CK*）合歡葉片的相對電導率、MDA 含量、SOD 酶活性較未接種組對照（CK）顯著降低，葉綠素、可溶性蛋白質含量顯著升高，進一步證明，接種根瘤菌增強了合歡幼苗的生理代謝活動，提高了抗性。本研究還考察了接種根瘤菌后，合歡幼苗在不同濃度Cd 脅迫下的生理反應。

Cd 對植物細胞的影響往往最先作用于細胞膜，使得細胞膜結構和功能受到破壞，導致細胞內電解質外滲[11]。因此，植株的膜透性（相對電導率）在一定程度上能夠反映出Cd 對植株的傷害情況。本文結果表明，低濃度（5 mg·L-1）Cd 脅迫下，接種根瘤菌組葉片的相對電導率與對照（CK）無顯著差異，說明合歡葉片可抵御低濃度Cd 脅迫對細胞膜的傷害；但該濃度Cd 脅迫下，根系的相對電導率卻顯著降低。說明合歡的根系比葉片對Cd 脅迫的響應更敏感。

植株體內MDA 含量作為膜系統受傷害程度的重要指標之一，其含量的多少也能反映出Cd 對植株的傷害情況。本研究表明，低濃度（5 mg·L-1）Cd脅迫下，接種根瘤菌組葉片的MDA 含量與CK 比，并未上升，說明根瘤菌共生有助于合歡抵御低濃度的Cd 脅迫，不使其膜系統受到過氧化傷害。

葉綠素含量的變化既可反映植物葉片光合能力的強弱,也可表征逆境脅迫下植物組織、器官的衰老狀況[12]。本研究表明，5-10 mg·L-1Cd 脅迫下，接種根瘤菌組葉綠素含量與CK 比，并未降低，說明接種根瘤菌后，合歡可以忍受5-10 mg·L-1Cd 脅迫，保護葉綠素不受Cd 毒害而發生降解。

接種根瘤菌后，合歡葉片的SOD 活性在5-15 mg·L-1Cd 脅迫下均比CK 顯著升高，說明合歡的保護酶系統發揮了重要的清除氧離子自由基的作用。

逆境脅迫下,植物體能夠通過代謝調控積累一些小分子有機物質進行滲透調節,緩解滲透脅迫[13]，可溶性蛋白質含量的高低在一程度上能夠反映植物對逆境脅迫的耐性。Hong 等[14]的研究表明，Cd脅迫誘導可溶性蛋白質含量增加,可能是植物抵抗Cd 毒害的一種解毒機制。Du 等[15]的研究表明,Cd脅迫使小麥幼苗中可溶性蛋白質含量下降。尹國麗[1]的研究也表明,隨Cd 脅迫濃度的增大,可溶性蛋白質含量減少。本試驗的結果與Du 及尹國麗等人的研究結果相同，可溶性蛋白質含量隨Cd 脅迫濃度的增大而下降，可能是因為Cd 脅迫處理時間較長,使得Cd 在合歡幼苗體內過量積累,導致蛋白質變性,造成可溶性蛋白質含量下降,蛋白水解酶的活性也因此受到抑制。但接種根瘤菌的合歡幼苗體內的可溶性蛋白質含量較未接種根瘤菌的合歡幼苗高，說明根瘤菌能誘導可溶性蛋白質含量增加，是一種根瘤菌協助合歡幼苗抵抗Cd 毒害的解毒機制。

總體來看，接種根瘤菌的合歡幼苗的生理反應均呈現出對較低濃度的Cd 脅迫有較好的耐性，能忍耐的最大Cd 脅迫濃度為15 mg·L-1，但在高濃度（25 mg·L-1）Cd 脅迫下并未表現出顯著的緩解Cd毒害的效果。

因此，可以說明，合歡作為高效固氮植物，與根瘤菌建立共生體系，可以忍受一定濃度的Cd 脅迫，可將其應用于Cd 污染土壤的生物修復，具有良好的應用前景。