響應面法優化柿渣中單寧提取工藝

沈永賢 陳戀真 陳燕珊 李浩權 黃汝恒 胡洪超

摘要：【目的】利用響應面法優化柿渣中單寧的提取工藝，為柿單寧的綜合開發利用提供技術支持。【方法】利用溶劑浸提法提取成熟柿渣中的單寧，采用福林酚法測定柿單寧含量，選取pH（水浸提取法）、乙醇體積分數（乙醇浸提法）、料液比、提取時間和提取溫度為因素，柿單寧提取率（Y）為響應值，在單因素試驗的基礎上進行Box-Behnken中心組合試驗設計，建立回歸方程，優化柿渣中單寧的提取工藝。【結果】3種提取方法獲得的柿單寧提取率排序為：堿性水浸>酸性水浸>乙醇浸提。選用堿性水浸提取法作為提取工藝，建立的回歸方程為：Y=1.75-0.0424A+0.0164B+0.0118C+0.01AB+0.0015AC-0.0005BC-0.2528A2-0.0003B2-0.0179C2（A為pH，B為提取時間，C為提取溫度）;3個因素對堿性水浸提取柿單寧提取率的影響排序為pH>提取時間>提取溫度，兩因素間的交互作用對柿單寧提取率的影響均不顯著（P>0.05）。最佳提取工藝條件：pH 11、料液比1∶3、提取時間129 min、提取溫度96.5 ℃，在此條件下獲得柿單寧提取率為1.75%，與理論預測值（1.76%）接近。【結論】采用響應面法優化柿渣中單寧的提取工藝穩定、可行，具有實用價值，可在生產實際中推廣。

關鍵詞： 柿渣;柿單寧;響應面;提取優化

中圖分類號： S665.209.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-3076-09

Optimization of the extraction process of persimmon tannin from persimmon residue by response surface methodology

SHEN Yong-xian1，CHEN Lian-zhen2，CHEN Yan-shan2，LI Hao-quan2，

HUANG Ru-heng2，HU Hong-chao1*

（1Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou? 510225， China; 2Guangzhou Shibio

Biotechnology Co.，Ltd.， Guangzhou? 510000， China）

Abstract：【Objective】The response surface methodology（RSM） was used to optimize the extraction process of persimmon tannin in persimmon residue，providing technical support for the extraction and separation of persimmon tannin and the comprehensive development and utilization of persimmon tannin. 【Method】Solvent extraction of persimmon tannin from persimmon residue was carried out. The persimmon tannin was determined by Folin-Ciocalteu method. The pH（water extraction）， volume fraction of ethanol（ethanol extraction），the material-liquid ratio，extract time，and extract temperature were selected as different experimental factors， persimmon tannin extraction rate（Y） as response value. Based on the experiment of single factor，the combined experimental design of Box-Behnken center was carried out. Establishing regression equation to optimize the extraction process of persimmon tannin from persimmon residue. 【Result】The results showed that the extraction rate of persimmon tannin： alkaline water extraction>acid water extraction>ethanol extraction.Established regression equation of alkaline water extraction was：Y=1.75-0.0424A+0.0164B+0.0118C+0.01AB+0.0015AC-0.0005BC-0.2528A2-0.0003B2-0.0179C2（A was the pH，B was the extraction time and C was the extraction temperature）. The influence order of the three factors on yield of extraction rate of persimmon tannin by alkaline water extraction was pH>extraction time>extraction temperature. The interaction between the two factors on extraction rate of persimmon tannin was not significant（P>0.05）.The optimal process conditions were：pH 11，solid-liquid ratio 1∶3，extraction time 129 min，extraction temperature 96.5℃，and the extraction yield was 1.75%，which was close to the theoretical prediction（1.76%）. 【Conclusion】The response surface method is used to optimize the extraction process of persimmon tannin in persimmon residue，which is stable and feasible. It has practical value and can be popularized in production.

Key words： persimmon residue; persimmon tannin; response surface methodology; extraction optimization

Foundation item： Guangdong-Hong Kong Cooperation Project（2017A050506055）; Guangdong Provincial Education Department Project（2017KZDXM045）

0 引言

【研究意義】柿子原產于我國，至今已有3000多年的栽培和加工歷史（楊恒等，2019）。截至2019年，我國柿子年產量達329.40萬t（國家統計局，2019）。目前，我國對柿子的開發利用主要是制作柿餅、柿醬、柿子酒、柿子醋及果汁飲料等，市場需求有限，以致柿子收購價低，大量的柿子被棄采而爛掉（王建新和徐冉，2019;馮娟等，2020）。研究表明，與五倍子單寧等植物多酚相比，柿單寧分子量大，結構復雜，更易與重金屬、蛋白質等形成絡合沉淀（張寶善和陳綿屏，1997;Akagi et al.，2010;Li et al.，2010），可用于空氣凈化（崔翠等，2015;嚴敬華，2020）、金屬離子回收（蔣文斌等，2018;易慶平等，2018）、作抗氧化劑（Tian et al.，2012）和材料改性處理等（Du et al.，2020）。柿子在加工成果汁、果酒和果醋后殘余的柿渣中富含果膠、柿單寧等物質（王西娜，2015），因此，研究柿渣中提取單寧的工藝既可為企業帶來顯著的經濟效益，又能促進以柿單寧為原料的下游產業發展，從根本上拓展市場對柿果的需求。【前人研究進展】近年來，越來越多學者開展了對柿單寧的研究。辛國賢等（2013）研究柿單寧粗提物對氨氣、醋酸、異戊酸、三甲胺和吲哚的除臭效果，發現柿單寧粗提物對這5種臭味化合物有明顯吸附能力，對異戊酸、三甲胺和吲哚的吸附能力尤其顯著;曾繁濠（2015）采用超聲輔助提取恭城月柿中的柿單寧，所得的水解單寧和縮合單寧提取率分別為80.61%和83.58%;Zhou等（2016）從柿葉中超聲輔助提取，經大孔樹脂純化得到純度為39.56%的單寧提取物，并探討了其抗輻射性能;高明敏（2019）用不同方法構建了氧化石墨烯—柿單寧（PT-GO）用于吸附水體中的亞甲基藍和磁性氧化石墨烯—柿單寧（Fe3O4/PT/GO）用于吸附水體中Er3+與孔雀石綠，發現PT-GO對亞甲基藍最大吸附量達256.58 mg/g;而Fe3O4/PT/GO對孔雀石綠的最大吸附能力可達560.58 mg/g，對Er3+的最大吸附量達366.67 mg/g，吸附過程均是自發和吸熱。李玉巍和孔祥舜（2019）對柿皮粉中的單寧進行提取和純化，得到其提取率為21.5%。近年來，在提取植物單寧的領域上也廣泛應用響應面法優化其提取工藝，如提取五倍子（秦清等，2012）、香蕉皮（劉細祥等，2014）、刺梨（李志等，2019）、苣荬菜根（賈貴華和任雪峰，2020）和桃金娘果（徐陽純等，2021）的單寧。【本研究切入點】目前，大多研究者主要從青柿渣（曾繁濠，2015）、柿葉（于曉銳等，2018）和青柿皮（李玉巍和孔祥舜，2019）中提取單寧，以成熟柿子渣為原料，通過響應面法優化柿單寧提取工藝的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】通過單因素試驗探討提取溫度、提取時間和料液比等因素對水浸提取法和乙醇浸提法對柿單寧提取率的影響;在此基礎上通過響應面試驗分析確定提取柿單寧的最佳工藝條件，為柿單寧后續生產和綜合利用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

柿渣由桂林柿寶生物科技有限責任公司提供。濃鹽酸（分析純）購自廣州化學試劑二廠，無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉、沒食子酸標準品和無水碳酸鈉均為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。主要儀器設備：數顯恒溫水浴鍋（HH-1，江蘇科析儀器有限公司）、TGL-16B離心機（上海安亭科學儀器廠）、RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）和新世紀紫外可見光分光光度計（T6，北京普析通用儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 柿單寧提取與分析 水浸提取法：取100.0 g柿渣，加入去離子水，調節pH，恒溫水浴加熱。酸性提取結束后離心，取上清液濃縮醇沉除果膠;堿性提取結束后，調節pH至5，離心，取上清液濃縮醇沉除果膠。乙醇浸提法：取100.0 g柿渣，加入酸性乙醇溶液，恒溫水浴加熱，提取結束后離心，取上清液進行濃縮。以上試驗均平行3次。

分析方法：采用Folin-酚法（Singleton et al.，1999;王勇等，2011）測定提取濃縮液中柿單寧含量。吸取適量的提取濃縮液，置于250 mL容量瓶中，提取濃縮液定容得到樣品液;吸取1 mL樣品液于100 mL容量瓶中，搖勻、定容;取1 mL稀釋后溶液于10 mL比色管中，加入2 mL去離子水，搖勻后加入1 mL F-D試劑和3 mL碳酸鈉溶液，定容至刻度線，搖勻，于50 ℃下水浴加熱5 min后，在760 nm波長處測定試液的吸光值。試驗平行重復3次，取平均值。根據Folin-酚法得到的標準曲線計算柿單寧濃度并代入公式，即可求得柿單寧提取率。

W（%）=C×V/（1000000×M）×100

式中，W為柿單寧提取率（%），C為柿單寧濃度（mg/L），V為定容體積（250 mL），M為柿子渣質量（100 g）。

1. 2. 2 單因素試驗 以柿單寧提取率為指標，考察pH（水浸提取法）、乙醇體積分數（乙醇浸提法）、料液比（柿渣與提取液質量之比，g/g）、提取時間和提取溫度等因素對柿單寧提取效果的影響。

1. 2. 2. 1 pH對水浸提取法柿單寧提取率的影響

分別設置pH為2、3、4、5、6（酸性條件）和8、9、10、11、12（堿性條件），在料液比1∶3、提取時間120 min、提取溫度100 ℃的條件下進行水浸提取，計算酸性條件和堿性條件下的柿單寧提取率。

1. 2. 2. 2 乙醇體積分數對乙醇浸提法柿單寧提取率的影響 分別設置乙醇體積分數為40%、50%、60%、70%和80%，在料液比1∶3、提取時間120 min、提取溫度60 ℃的條件下進行乙醇浸提，計算柿單寧提取率。

1. 2. 2. 3 料液比對柿單寧提取率的影響 分別設置料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶6，在pH 2和pH 11、提取時間120 min、提取溫度100 ℃的條件下進行水浸提取;在乙醇體積分數60%、提取時間120 min、提取溫度60 ℃的條件下進行乙醇浸提，各計算其柿單寧提取率。

1. 2. 2. 4 提取時間對柿單寧提取率的影響 分別設置提取時間為30、60、90、120和150 min，在pH 2和pH 11、料液比1∶3，提取溫度100 ℃的條件下進行水浸提取;在乙醇體積分數60%、料液比1∶3、提取溫度60 ℃的條件下進行乙醇浸提，各計算其柿單寧提取率。

1. 2. 2. 5 提取溫度對柿單寧提取率的影響 在水浸提取法中，分別設置提取溫度為60、70、80、90和100 ℃，在pH 2和pH 11、料液比1∶3、提取時間120 min的條件下進行提取，計算柿單寧提取率。在乙醇浸提法中，分別設置提取溫度為30、40、50、60和70 ℃，在乙醇體積分數60%、料液比1∶3、提取時間120 min的條件下進行提取，計算柿單寧提取率。

1. 2. 3 響應面試驗設計 以單因素試驗中柿單寧提取率為指標，發現堿性水浸提取效果遠比酸性水浸提取和乙醇浸提好，故采用堿性水浸提取法，固定料液比為1∶3，以柿單寧提取率（Y）為指標，選取pH、提取時間和提取溫度作為響應面試驗因素;采用Design-Expert 12.0進行Box-Behnken設計響應面試驗并分析。響應面試驗因素及水平設計見表1。

1. 3 統計分析

試驗各平行3次，取平均值。響應面數據采用Design-Expert 12.0進行統計分析，使用OriginPro 2021制圖。

2 結果與分析

2. 1 水浸提取法單因素試驗結果

2. 1. 1 pH對柿單寧提取率的影響 由圖1可知，堿性條件下的柿單寧提取效果優于酸性條件，在pH=2和pH=11時分別達相應條件下的最大提取率，分別為0.68%和1.70%。酸性條件下，隨著pH的降低即酸性的增強，柿單寧提取率逐漸提高;堿性條件下，隨著pH的升高，柿單寧提取率呈先增后減的變化趨勢。綜合考慮，采用pH=2（酸性水提）和pH=11（堿性水提）作為后續試驗條件。

2. 1. 2 料液比對柿單寧提取率的影響 由圖2可知，增加水對柿果的比例，酸性條件下的單寧提取率略有提高，堿性條件下的單寧提取率變化則不明顯。一般來說，增加提取液用量有助于提取率增加，堿性條件增加不明顯可能是因為柿單寧在堿性條件下易達到最大溶出量，單純增加提取劑用量對其溶出作用已不大。因此柿單寧提取工藝中料液比可確定為1∶3。

2. 1. 3 提取時間對柿單寧提取率的影響 從圖3可看出，在酸性和堿性條件下，隨著提取時間的延長，柿單寧提取率逐漸增大，當提取時間從60 min延長至120 min時，堿提率從1.07%升至1.75%，增加63.55%;酸提率從0.53%升至0.81%，增加52.83%，但120 min后提取率略有下降。理論上提取時間越長柿單寧提取就越充分，提取率就越高，但另一方面，柿單寧受熱條件下極易發生氧化和自聚等反應（Xia et al.，2015），導致柿單寧提取率降低，因此響應面試驗的提取時間水平選擇110、120和130 min為宜。

2. 1. 4 提取溫度對柿單寧提取率的影響 由圖4可知，在酸性和堿性條件下，隨著提取溫度的升高，柿單寧提取率均逐漸增大。這是因為提取溫度的升高會促使柿渣中的組織結構破壞，增加柿果中果膠溶解度，促進柿單寧溶出，提高柿單寧提取率。響應面試驗中提取溫度水平設為90、95和100 ℃。

2. 2 乙醇浸提法單因素試驗結果

2. 2. 1 乙醇體積分數對醇提柿單寧提取率的影響

由圖5可知，在乙醇體積分數為40%～80%范圍內，柿單寧提取率先增加后減少，在乙醇體積分數為60%時提取率達最大值，為0.2367%;當乙醇體積分數從40%升至60%時，柿單寧提取率從0.2133%提高至0.2367%，提高10.97%;而在乙醇體積分數從60%升至80%時，柿單寧提取率由0.2367%降低至0.1933%，降低18.34%。

2. 2. 2 料液比對醇提柿單寧提取率的影響 如圖6所示，隨著乙醇溶液用量的增加，柿單寧提取率逐漸升高，但變化不明顯。提取率提升可能是因為乙醇用量的增加增大了柿渣與提取劑的接觸面積，促進柿單寧浸出;但整體上柿單寧提取率提升趨勢變化較小，提取率也無明顯變化，可能是柿單寧在乙醇溶液中基本達到最大溶解限度，繼續增加乙醇用量已無法浸出更多的柿單寧所致。

2. 2. 3 提取時間對醇提柿單寧提取率的影響 如圖7所示，隨著提取時間的延長，柿單寧提取率逐漸增大且趨勢明顯。當提取時間從60 min延長至120 min時，提取率從0.1230%上升至0.2373%，增加92.93%;當提取時間超過120 min后，柿單寧提取率趨于平穩且有緩慢降低的趨勢。

2. 2. 4 提取溫度對醇提柿單寧提取率的影響 從圖8可看出，隨著提取溫度的提高，柿單寧提取率先升高后降低，60 ℃時達最大值，為0.2280%。當提取溫度在30～60 ℃時，溫度的升高促進柿單寧在乙醇體系中的浸出，且其對乙醇的蒸發影響有限，因此柿單寧提取率保持增加;但當提取溫度超過60 ℃時，隨著溫度的升高，乙醇逐漸被蒸發，體系中溶劑質量不斷減少，使得柿單寧浸出量變少，故柿單寧提取率也相應降低。

2. 3 響應面試驗結果

2. 3. 1 回歸方程建立及方差分析結果 采用Design-Expert 12.0設計響應面（Box-Behnken）試驗，結果如表2所示。共設計17個試驗點，設5個零點及12個分析因點，其中自變量為分析因點，取值（以單因素試驗結果為基礎）于pH（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）中所構成的三維頂點，零點為pH、提取時間和提取溫度的中心點，為保證試驗重復性，點試驗進行3次，以降低不可控因素對試驗的干擾。對表2中的試驗數據進行回歸分析，得到柿單寧提取率理論值（Y）與pH（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）的回歸方程為：Y=1.75-0.0424A+0.0164B+0.0118C+0.01AB+0.0015AC-0.0005BC-0.2528A2-0.0003B2-0.0179C2。

對該模型進行方差分析及回歸系數的顯著性檢驗，結果如表3所示，一次項中，A、B對柿單寧提取率的線性效應極顯著（P<0.01，下同），C則是顯著（P<0.05，下同）;二次項中，A2的影響為極顯著，C2為顯著;交互作用中，AB、AC和BC 3項均不顯著（P>0.05）。在整個試驗設計范圍內，模型的顯著性檢測P<0.0001，極顯著;模型的R2為0.9971，調整R2為0.9933，說明該模型與實際試驗結果的擬合程度良好。根據顯著性和F可知，影響堿性水浸提取柿單寧提取率的因素排序為pH（A）>提取時間（B）>提取溫度（C）。

2. 3. 2 響應曲面三維圖和等高線分析結果 依照回歸方程，繪制響應曲面和等高線，觀察擬合響應曲面的形狀，研究pH、提取時間和提取溫度對堿性條件水浸提取柿單寧提取率的影響。各因素及其相互作用對響應值的影響可通過各直觀圖反映出來，回歸方程的響應曲面及其等高線如圖9～圖11所示。從圖9和圖10可看出，同一pH條件下，提取時間和提取溫度對柿單寧提取率的影響不大，即AB和AC的交互作用較弱，柿單寧提取率的主要影響因素是pH;圖11結果則說明BC的交互作用較差。綜合來看，在確定pH的情況下，提取時間和提取溫度對柿單寧提取率的影響較小。

2. 3. 3 驗證試驗結果 依據響應面分析結果，得到從柿渣中提取柿單寧的最佳理論堿性水浸提取工藝條件為：pH 11，提取時間129 min，提取溫度96.5 ℃，該條件下理論柿單寧提取率為1.76%。為驗證響應面分析法分析結果的可靠程度，選用以上優化的試驗條件進行驗證試驗，共進行3次平行試驗，得到平均提取率為1.75%，與理論預測值的相對誤差為0.57%，與預測值接近，說明建立的模型可靠，適用于堿性水浸提取柿單寧工藝的優化，具有實用價值。

3 討論

本研究選用水浸提取法和乙醇提取法對成熟柿渣中的柿單寧進行提取，2種方法均為提取植物多酚類物質的常用手段。近年來不少研究者對不同柿子種類、部位進行單寧提取研究，得到較高的單寧提取率，如曾繁濠（2015）提取恭城青澀柿中的水解單寧（2.364%）和縮合單寧（3.042%），楊瓊瓊（2016）從柿木皮中提取單寧（5.6%），李玉巍和孔祥舜（2019）對柿皮粉（0.1722%）進行相關研究，陳美紅等（2009）則研究了未成熟羅田甜柿中柿蒂和柿核部位的單寧含量（分別為50.9%和60.7%）。與上述前人研究結果相比，本研究的柿單寧提取率較低，不同方法提取柿單寧的效果為：堿性水浸提取>酸性水浸提取>乙醇提取。這是因為本研究選用的原料為成熟柿子渣，其自身柿單寧含量較少而果膠含量較多，故柿單寧提取率較低。同時，由于柿單寧和果膠常呈現締合狀態，乙醇浸提法中果膠不易從柿果渣中溶出，因此柿單寧乙醇浸提法的提取率反而不如水浸提取法。在堿性水浸提取下，果膠溶解性更好（Fraeye et al.，2007;Jiang et al.，2020），提取過程中柿單寧和果膠能更好地分離，柿單寧溶出率增加;但堿性過高時，柿單寧提取率反而有所降低，說明柿單寧在強堿性溶液中部分發生降解，與Osawar和Walsh（1993）的研究結果一致。此外，酸性條件下柿單寧提取率隨酸性增強而提高，是因為酸性條件下柿單寧結構內作用力減弱，柿單寧酚羥基暴露程度加強，柿單寧從不溶性單寧轉化為可溶性單寧，且酸性越強柿單寧水解程度越強，提取率也越高（石碧和狄瑩，2000）。而在乙醇提取中，乙醇體積分數為40%～60%的范圍內柿單寧提取率較高，是因為該體積分數下的乙醇有利于破壞柿渣中柿單寧與蛋白質、多糖等物質之間的氫鍵和疏水作用力（張艷萍等，2009），使其單寧的溶出更容易;當乙醇體積分數進一步提高時，柿單寧提取率反而下降，這是因為提取劑與柿單寧的極性差異開始增大，柿單寧的溶出量減少，與李西柳（2010）的研究結果一致。

由于堿性水浸提取法單寧提取率明顯高于其他提取工藝，因此選取柿單寧堿法浸提工藝進行響應面試驗，以獲取最佳提取工藝條件。同時，因為料液比低于1∶3后基本不影響提取率的增加，說明該因素的影響較少，考慮后續生產中的濃縮、干燥工序成本，故料液比不作為響應面研究參數，固定為1∶3，即考察pH、提取時間和提取溫度對單寧提取率的影響。根據響應面和等高線結果，發現在堿性水浸提取中，pH與提取時間、pH與提取溫度之間的交互作用較弱，柿單寧提取率的主要影響因素是pH。而在確定pH的情況下，提取時間與提取溫度之間的交互作用也較差，對柿單寧提取率的影響較小。利用響應面法不僅能分析各因素間交互作用對響應值的影響，還可優化柿渣中柿單寧提取工藝，有助于轉化成工業實際生產，有利于節約資源保護環境，提高柿子的高附加值利用。為更深入地了解柿單寧的效用，下一步將對柿單寧實際應用方面進行研究。

4 結論

本研究通過單因素試驗和響應面分析對柿渣中提取柿單寧的工藝進行優化，比較發現堿性水浸提取的提取率較高，優化后的工藝條件為：pH 11、料液比1∶3、提取時間129 min、提取溫度96.5 ℃。試驗精確度較高，操作簡單，可用于從柿渣中提取柿單寧。

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收稿日期：2021-04-08

基金項目：粵港合作項目（2017A050506055）;廣東省教育廳項目（2017KZDXM045）

通訊作者：胡洪超（1980-），https：//orcid.org/0000-0002-9070-5893，博士，主要從事天然產物提取與環境功能材料研究工作，E-mail：samhuhongchao@gmail.com

第一作者：沈永賢（1996-），https：//orcid.org/0000-0001-7057-9968，研究方向為環境功能材料，E-mail：sumwingjin@163.com