磺胺類抗生素對玉米幼苗生長、生理及代謝組的影響

賁蓓倍 劉海學 李娜 楊仁杰

摘要：【目的】研究典型磺胺類抗生素（Sulfonamides，SAs）對玉米幼苗生長、生理及代謝組的影響，為進一步探究玉米對SAs的響應機制提供理論依據。【方法】以玉米品種鄭單958和掖單13為試驗材料，以不添加SAs為對照（0 mg/L），以終濃度為10、20、30、40和50 mg/L的磺胺甲基嘧啶（SM1）和磺胺二甲基嘧啶（SM2）為處理，測定分析對照及不同處理玉米幼苗的生長和生理指標，并通過氣相色譜—質譜聯用儀（GC-MS）對玉米幼苗代謝物的含量及種類進行檢測。【結果】2種SAs處理后，玉米幼苗的根長、株高、鮮重、干重和葉綠素含量總體上表現出低促高抑的變化趨勢。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性被激活，總體變化趨勢為先上升后下降。經GC-MS檢測出代謝物共70種，主要為有機酸、氨基酸、糖類及其衍生物和其他代謝物，將篩選到的12種差異代謝物富集到代謝通路上，結果映射得出7條顯著的代謝路徑：氨酰基-tRNA的生物合成，氰氨基酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，乙醛酸和二羧酸的代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，異喹啉生物堿的生物合成。【結論】SAs對玉米幼苗生長和生理指標的影響呈低促高抑的效果。高濃度SAs使玉米幼苗生長受抑，光合色素含量降低，遭受氧化損傷，具有不可忽視的生態毒性。氨基酸類代謝物為玉米幼苗響應SAs的關鍵代謝物。鄭單958對SAs的耐性比掖單13強。

關鍵詞： 磺胺類抗生素;玉米;生長;生理;代謝組

中圖分類號： S513? ? ? ? ? ? ? ? ? ?   ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-2977-09

Effects of sulfonamides on the growth，physiology and metabolome of maize seedlings

BEN Bei-bei1， LIU Hai-xue1*， LI Na2， YANG Ren-jie1

（1Tianjin Agricultural University， Tianjin? 300384， China; 2Fushun Forestry Development Service

Center， Fushun， Liaoning? 113000， China）

Abstract：【Objective】In this study， we explored the effects of typical sulfonamide antibiotics（Sulfonamides， SAs） on the growth， physiology and metabolome of maize seedlings， in order to provide a theoretical basis for further explo-ring the response mechanism of maize to SAs. 【Method】 Two kinds of maize varieties （Zhengdan 958 and Yedan 13） were selected as the research materials with no added SAs as the control （0 mg/L）， or with final concentrations of 10，20， 30， 40 and 50 mg/L sulfamerazine（SM1） or sulfamethazine （SM2） as the treatments. The growth and physiological indicators of maize seedlings were determined and the types and contents of metabolites of maize seedlings were detected by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）. 【Result】After SAs treatment，the root length，plant height，fresh weight dry weight and chlorophyll of maize seedlings showed a trend that low concentration promoted but high concentration inhibited growth. The activities of superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and? catalase（CAT） enzymes were activated，and overall，the trend of change was firstly rising and then falling. A total of 70 metabolites were detected by GC-MS，mainly organic acids，amino acids，sugars and their derivatives and other metabolites.12 different metabolites were obtained，which were enriched on the metabolic pathways，and 7 significant metabolic pathways were mapped out：aminoacyl-tRNA biosynthesis;cyanoamino acid metabolism;alanine，aspartate and glutamate metabolism;valine，leucine and isoleucine biosynthesis;glyoxylate and dicarboxylate metabolism;glycine，serine and threonine metabolism;isoquinoline alkaloid biosynthesis. 【Conclusion】For maize seedlings treated with SAs，they show the effect of being promoted at low concentrations but inhibited at high concentrations. The high concentration of SAs inhibits the growth of maize seedlings，reduces the photosynthetic pigment content，suffers oxidative damage，and has a non-negligible ecotoxicity. Amino acid metabolites are the key metabolites of maize seedlings in response to SAs stress. The resistance of Zhengdan 958 against SAs is stronger than Yedan 13.

Key words： sulfonamids; maize; growth; physiology; metabolome

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（41771357）

0 引言

【研究意義】近年來，抗生素污染逐漸受到關注。其中，磺胺類抗生素（Sulfonamids，SAs）是一類人工合成的有機物質，因其具有成本低、抗菌譜性廣和穩定性強等優點而被廣泛應用（陳姍等，2019）。SAs在使用后僅有小部分參與生物體代謝，大部分會以原藥形式直接排放至多個環境介質，具有潛在的生態風險（Kumar et al.，2005）。玉米是我國典型糧食作物之一，具有極強的環境適應能力（趙久然等，2018）。在當前環境污染不斷加劇的背景下，研究抗生素污染對玉米生長、生理及代謝變化的影響，對探究玉米響應逆境的機理具有重要意義，同時也可為抗逆玉米品種的選育提供新思路。【前人研究進展】抗生素長期暴露會改變土壤微生物群落的功能和結構多樣性（Gutiérrez et al.，2010），誘發抗性菌及抗性基因的傳播（張蘭河等，2016;Grenni et al.，2019），進而產生新型污染。同時，抗生素能被植物吸收、轉運并積累，影響植物的光合作用和正常生長。有研究顯示，SAs可改變植物的根系地向性，對根系生長產生不利影響，影響水分吸收，具有很強的損害植物性能和生物量毒害作用（Michelini et al.，2012）。四環素類抗生素會降低淡水綠藻的細胞膜透性，造成嚴重的毒害作用進而抑制其生長（徐冬梅等，2013）。高濃度的土霉素污染對水稻苗期的生長及葉綠素含量具有顯著抑制作用（徐秋桐等，2016）。隨著SAs濃度的提高，苦草葉綠體的膜系統受到損傷，結構變形，嚴重的會造成葉綠體解體，進而影響光合作用（趙秀俠等，2017）。李亞寧等（2017）發現SAs在低濃度、高濃度染毒處理下能顯著抑制油菜葉片葉綠素的合成。司雄元等（2018）研究表明，SAs在單一脅迫、復合脅迫下，隨著處理濃度的升高，對小白菜的生長及葉綠素產生抑制作用，毒性作用表現為磺胺二甲基嘧啶強于磺胺。抗氧化酶是植物體內負責清除由環境影響產生的自由基的重要保護酶，其中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）是最主要的3種酶。肖明月等（2014）以小白菜為研究對象，對其進行6種常見抗生素處理，結果表明，6種抗生素均能顯著誘導小白菜可溶性蛋白積累，對其抗氧化酶系統平衡造成破壞。嚴青云等（2016）發現環丙沙星對不同品種菜心的氧化損傷程度不同，高積累菜心品種對可溶性蛋白、POD和SOD活性的誘導作用強于低積累菜心品種，因此高積累菜心品種受到的氧化損傷較低積累菜心品種小。還有學者發現，隨著抗生素濃度增加，小麥幼苗中的SOD活性顯著增加，而CAT活性顯著降低（Riaza et al.，2017）。經四環素與金霉素、四環素與磺胺嘧啶復合脅迫后，小白菜的SOD、POD和CAT活性均受到抑制，且受到的抑制作用強于單一抗生素處理（宮曉雙等，2019）。【本研究切入點】代謝物是生物系統響應環境的體現者，通過確定和量化代謝物并對其進行信息提取與分析，以達到解釋生化途徑和響應機理的目的（Fiehn，2002），因此代謝組學是一個用于分析作物響應逆境的高效工具。但目前抗生素對植物影響的研究多集中在生長及生理影響方面（王朋等，2011;Ahmed et al.，2015），鮮有對代謝組影響的報道。【擬解決的關鍵問題】以2個玉米品種為研究材料，對其進行2種SAs處理，測定并分析生長、生理及代謝組學相關指標，研究典型SAs對玉米幼苗生長的影響，以期為進一步探究玉米對SAs的響應機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

玉米品種為鄭單958和掖單13;SAs為磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SM1）和磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine，SM2），分別購于Aladdin和Macklin公司，純度均為99%。

1. 2 試驗方法

玉米幼苗培養采用水培法。玉米種子經75%酒精消毒15 min，經蒸餾水清洗5遍后置于培養盒中，于27 ℃黑暗催芽48 h，培養介質為去離子水。待種子露白后均勻選取15粒玉米種子置于27 ℃恒溫培養箱中進行培養，光照12 h/黑暗12 h，光照強度4000 lx，濕度為60%，培養介質為Hoagland’s營養液。待培養至3葉1心期時，將培養介質換成SAs終濃度為10、20、30、40和50 mg/L的營養液，每處理重復3次，處理7 d。以不添加SAs的Hoagland’s營養液培養為對照（0 mg/L）。培養結束后收集玉米幼苗，洗凈、吸干水分后進行生長、生理指標及代謝物測定。

1. 3 生長及生理指標測定

1. 3. 1 生長指標測定 在各處理中選取長勢均勻的玉米幼苗6株，測定株高、根長和鮮重，經105 ℃殺青15 min，75 ℃烘至恒重，測定干重。

1. 3. 2 生理指標測定 生理指標參照蒼晶和趙會杰（2013）的方法進行測定。葉綠素含量采用分光光度法測定，SOD活性采用氮藍四唑光還原法測定，POD活性采用愈創木酚法測定，CAT活性采用分光光度法測定。

1. 4 代謝物提取及GC-MS條件

1. 4. 1 代謝物提取 將收集到的玉米幼苗全株經液氮研磨，混勻后稱取150.0 mg于1 mL異丙醇-乙腈-水提取液（1∶1∶1，V/V/V）中4 ℃超聲提取30 min，離心1 min（4 ℃，10000 r/min），吸取150 μL上清液氮吹后進行衍生（第一步：加入10 μL鹽酸甲氧胺吡啶，30 ℃衍生90 min;第二步：加入30 μL MSTFA+1% TMCS，37 ℃衍生30 min），最后加入1 mL（含20 μg十一烷內標物）正庚烷溶液，經0.22 μm濾膜過濾，濾液即為待測液。重復3次。

1. 4. 2 GC-MS條件 實驗儀器為7890 A-5975 C型氣相色譜—質譜聯用儀（Aglient公司）。色譜條件：色譜柱為Aglient 19091S-433HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣為氦氣（純度99.999%），不分流進樣。升溫程序為常溫升至60 ℃后維持1 min，以10 ℃/min升至270 ℃后運行35 min。質譜條件：電子碰撞內能70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲6 min，掃描速度2 scan/s，范圍50～500 m/z，全掃描模式。

1. 5 統計分析

利用Excel 2019進行數據整理及計算，運用SPSS 26.0進行數據的差異性分析，Origin 2019制圖。通過SIMCA-P 13.1對代謝組數據進行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），利用Metabo Analyst平臺進行代謝途徑分析。

2 結果與分析

2. 1 SAs對玉米幼苗生長指標的影響

由圖1可看出，SAs處理對玉米的生長指標均產生了一定程度的影響。在對株高的影響上，隨著SM1、SM2濃度的升高，與對照相比，鄭單958總體上表現出先被促進后被抑制的變化趨勢， SM1和SM2的臨界濃度[即指標受到顯著（P<0.05，下同）抑制的最小處理濃度，下同]分別為30和40 mg/L;掖單13株高的變化趨勢與鄭單958相似，但在SAs處理范圍內并未受到顯著抑制（P>0.05，下同）。在對根長的影響上，隨著SM1和SM2濃度的升高，與對照相比，鄭單958表現出先被促進后被抑制的變化趨勢，SM1和SM2的臨界濃度分別為40和30 mg/L，掖單13則在SM1和SM2處理濃度范圍內均被抑制，臨界濃度分別為20和10 mg/L。在對鮮重和干重的影響上，隨著SM1和SM2濃度的升高，鄭單958鮮重和干重的變化趨勢一致，與對照相比，均表現為先被促進后被抑制。鄭單958在SM1處理下鮮重和干重的臨界濃度分別為30和40 mg/L，在SM2處理下鮮重和干重的臨界濃度均為30 mg/L。掖單13在SM1處理濃度范圍內鮮重和干重均被抑制，其中在20～50 mg/L范圍內抑制作用顯著，鮮重和干重的臨界濃度均為20 mg/L。在SM2處理下，掖單13的鮮重和干重表現為10 mg/L時被促進，20 mg/L時被顯著促進，而30～50 mg/L時被顯著抑制，臨界濃度均為30 mg/L。

2. 2 SAs對玉米生理指標的影響

2. 2. 1 SAs對玉米幼苗葉綠素含量的影響 從圖2可看出，鄭單958經SAs處理后，與對照相比，在SM1處理下，葉綠素含量在10 mg/L時顯著降低，在20～30 mg/L時有所提高但與對照差異不顯著，在40～50 mg/L時顯著降低;在SM2處理下，葉綠素含量整體呈先升高后降低的變化趨勢，40～50 mg/L時表現出顯著抑制作用。其中SM2處理下的葉綠素含量變幅（-48%～8%）大于SM1處理（-19%～2%），SM1處理的臨界濃度為10 mg/L，SM2處理的臨界濃度為20 mg/L。掖單13經SAs處理后，從變幅看，SM1處理下的葉綠素含量變幅（-17%～21%）大于SM2處理（-12%～12%），SM1和SM2處理的臨界濃度均為40 mg/L。

2. 2. 2 SAs對玉米幼苗抗氧化酶活性的影響 抗氧化酶是植物體內重要的保護酶體系，其變化反映植物抗氧化損傷的能力。從圖3可看出，鄭單958和掖單13經SAs處理后，SOD和POD活性均高于對照，整體表現為先上升后下降的變化趨勢，表明酶的保護作用有限，在達到最大限度后酶活性會逐漸降低。其中，在SM1處理下，鄭單958和掖單13的SOD活性均在濃度為20 mg/L時達最高值;在SM2處理下，2個品種的SOD活性均在濃度為30 mg/L時達最高值，SM1的最大促進作用濃度小于SM2，表明SM1對SOD活性的影響比SM2大。POD活性在SM1和SM2處理下均在濃度為30 mg/L時達最高值。在SM1處理下，鄭單958和掖單13的CAT活性均表現出低濃度被促進高濃度被顯著抑制的趨勢，臨界濃度分別為50和40 mg/L。在SM2處理下，鄭單958的CAT活性均高于對照，濃度為40 mg/L時CAT活性最高;掖單13的CAT活性表現出低濃度被促進高濃度被顯著抑制的趨勢，臨界濃度為50 mg/L。總體而言，SM1處理對玉米抗氧化酶活性的影響相對更大，鄭單958在同等條件下其抗氧化酶活性受SAs的影響小于掖單13。

2. 3 SAs對玉米幼苗代謝物的影響

2. 3. 1 代謝物種類鑒定 采用GC-MS檢測玉米幼苗代謝物，結果共鑒定出70種代謝物，包括有機酸27種、糖類及其衍生物18種、氨基酸14種和其他有機物11種，分別占總代謝物總數的38.6%、25.7%、20.0%和15.7%。

2. 3. 2 代謝物的多元統計分析 將3組生物學重復代謝物數據取平均值后進行多元統計分析，經PCA分析得到得分圖（圖4-A），結果表明，鄭單958和掖單13的樣品能較好區分開來，說明SAs對玉米的影響具有顯著的品種差異性;掖單13樣品分散性較鄭單958樣品大，表明掖單13受SAs的影響大于鄭單958。就單一品種而言，不同SAs處理的樣品分離效果不理想。因此，需進一步進行PLS-DA分析。

通過PLS-DA得分圖（圖4-B）可見，SM1、SM2處理總體上能分開，掖單13樣品的分離效果優于鄭單958樣品。就SM1處理而言，2個玉米品種均表現出20和50 mg/L間代謝物差異較小，30和40 mg/L間代謝物差異較小。就SM2處理而言，掖單13各樣品間差異不明顯，鄭單958樣品中，30 mg/L與其他樣品差異明顯。由此可見，在同一濃度范圍內，SM1對玉米的影響大于SM2。經過200次置換模型檢驗，Q2值與R2Y值均低于相應的原始值，因此判斷模型未存在過擬合現象，可依據其給出的變量投射重要度（Varia-ble importance for the projection，VIP）篩選差異代謝物。

2. 3. 3 差異代謝物分析 將PLS-DA分析中得到的VIP值結合單因素方差分析P值篩選差異代謝物（VIP>1，P<0.05），結果（表2）顯示，最終篩選出12種差異代謝物，為8種氨基酸和4種有機酸。由此可見，SAs對玉米幼苗中氨基酸類和有機酸類代謝物含量的影響較大。

對差異代謝物進行含量的變化倍數分析，log2FC>0表示上調，log2FC<0表示下調，|log2FC|>1表示顯著上調或顯著下調。由表3可知，就掖單13樣品中的氨基酸含量而言，SM1、SM2在各濃度處理均表現上調趨勢，除YA10、YB10、YB20和YB50外，其他濃度均表現出顯著上調作用。就鄭單958樣品中的氨基酸含量而言，除ZB20外，SM1、SM2在各濃度處理均表現上調趨勢，但均未達顯著水平。表明SAs對掖單13樣品影響較顯著。在掖單13樣品中，SM1和SM2處理在10～40 mg/L范圍內，氨基酸含量隨著濃度的上升而上升，在40 mg/L表現出最大的積累作用，而在50 mg/L時積累減少。就2個品種玉米樣品中的有機酸含量而言，SM1、SM2對其含量的影響或上升或下降，但均未達顯著水平。

2. 4 SAs對玉米幼苗代謝途徑的影響

將差異代謝物導入Metabo Analyst平臺進行分析，依據P<0.05或Impact>0.2的判斷標準，最終篩選出具有顯著意義的7條代謝通路（表4）。表4中標注了代謝路徑參與的總代謝物個數（Total）及匹配到的玉米幼苗的代謝物個數（Hits）。Impact值表示經拓撲分析得出的代謝路徑影響值。變化顯著的代謝通路中超過半數通路與氨基酸的代謝和合成有關，說明SAs對玉米幼苗中氨基酸的代謝途徑具有明顯影響。

3 討論

3. 1 SAs對玉米幼苗生長和生理指標的影響

有研究表明，經抗生素處理后，水芹的生長在低濃度被促進，而在高濃度時呈現出顯著的抑制效果。對SAs處理下的玉米幼苗生長進行研究，觀察到隨著SAs濃度的升高，各生長指標表現出低促高抑的效果，與鮑陳燕等（2016）關于抗生素脅迫對水芹生長影響的研究結果一致。這種低促高抑現象的出現，有可能是當SAs處于較低濃度時，抗逆活動的激發使代謝活動同步增強，進而促進了植物的生長（周文禮等，2009），這一猜想也在本研究的代謝組學分析中得到印證。而SAs處于較高濃度時，植物對SAs的吸收和轉運活動增強，內環境的穩定被破壞（遲蓀琳等，2018），最終導致生長被抑制。

光合作用是植物最重要的環節之一，其正常穩定運作是能量來源和營養積累的基礎，同時也是響應逆境的重要體現（Abbasi et al.，2015）。葉綠素是植物光合作用的重要組成部分，其含量的變化能客觀反映生物體受到的影響。本研究結果表明，高濃度SAs能抑制玉米幼苗葉綠素的合成。有研究表明，高濃度的抗生素能抑制光合色素和光合作用相關蛋白的合成，使葉綠體產生結構性損傷，最大光合速率下降，呼吸作用升高，最終影響光合作用（Kasai，2004;Vannini et al.，2011）。

抗氧化酶系統是植物體內清除活性氧自由基的重要保護酶系統，植物在受到逆境脅迫時，體內的抗氧化酶體系會被激活（魏瑞成等，2011;李亞寧等，2017）。在SAs處理下，SOD、POD和CAT活性均被激活，表明玉米幼苗受到了氧化損傷。本研究中，抗氧化酶活性的變化趨勢為先上升后下降，表明植物抗氧化體系抵御逆境的能力有一定限度。當SAs濃度超過植物的耐受極限，SAs的富集作用使氧化損傷作用加深，或與關鍵酶活位點相結合形成絡合物，最終使酶活性降低（宮曉雙等，2019）。

3. 2 SAs對玉米幼苗代謝物及代謝途徑的影響

經代謝組學分析玉米幼苗中差異代謝物含量變化，發現氨基酸含量變化顯著，但有機酸含量變化較小。差異氨基酸含量隨SAs濃度的升高呈先上升后下降的變化趨勢，說明隨著SAs脅迫的加劇，玉米幼苗的抗逆活動增強，但超過一定的耐受限度后，抗逆活動會減弱，進而受到損害。

氨基酸是生物體受到環境壓力的響應者，其變化對研究生物體抗逆性有重要的指導作用。燕輝等（2012）研究發現，在鹽脅迫條件下，花棒葉片的丙氨酸、脯氨酸等主要游離氨基酸不斷合成與積累，參與滲透調節與離子運輸等活動，以達到緩解逆境傷害的作用。本研究中，除丙氨酸外，SAs脅迫導致差異氨基酸含量總體上升，與燕輝等（2012）的研究結果相似。此外，4條與氨基酸相關的代謝途徑變化顯著，表示玉米幼苗在SAs脅迫時氨基酸活動較活躍，是響應SAs脅迫的重要調節物質。氨基酸是合成抗逆蛋白的重要原料。本研究中，氨酰基-tRNA的生物合成途徑變化顯著，表明蛋白質的合成也較活躍。在受到SAs脅迫時，玉米幼苗可合成相關的抗逆蛋白，減輕逆境損傷，維持細胞液和細胞結構的穩態，保證生物體的正常生長發育及代謝（王艷蓉等，2015）。

有機酸是參與植物抗逆的滲透性物質。本研究中，各SAs處理使有機酸含量或上升或下調，但影響均不顯著，推測玉米幼苗在響應SAs脅迫時，有機酸參與抗逆但可能不是主要環節。戴凌燕等（2017）在甜高粱響應蘇打鹽堿脅迫的研究中發現氨基酸生物合成和二羧酸代謝途徑達顯著水平。有報道發現，棉花在遭遇鹽脅迫時，乙醛酸和二羧酸代謝途徑與抗逆相關性較大，主要通過平衡植物體內局部代謝紊亂，加快能量代謝以提高耐性（王德龍等，2010）。本研究與上述前人研究結果一致，表明乙醛酸和二羧酸的代謝路徑在玉米幼苗響應逆境的調控中起積極作用。

異喹啉生物堿是一類具有清除自由基和抗脂質過氧化活性的物質（程軒軒等，2006）。耐鹽番茄（張國儒等，2018）、耐冷黃芪（華夢藝等，2017）在逆境下均能使異喹啉生物堿生物合成的相關基因上調達顯著水平，使植物體減輕或消除因脅迫而造成的傷害。本研究中，異喹啉生物堿的生物合成途徑變化顯著，推測其可能在玉米幼苗SAs脅迫響應中起重要作用。

4 結論

SAs對玉米幼苗生長和生理指標的影響呈低促高抑的效果。高濃度SAs使玉米幼苗生長受抑，光合色素含量降低，遭受氧化損傷，具有不可忽視的生態毒性。氨基酸類代謝物為玉米幼苗響應SAs的關鍵代謝物，可從氨基酸動態變化的角度進一步研究玉米響應抗生素的機理。總體來說，鄭單958對SAs的耐性比掖單13強，可做為抗逆研究的供試材料。

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收稿日期：2021-02-06

基金項目：國家自然科學基金項目（41771357）

通訊作者：劉海學（1965-），http：//orcid.org/0000-0001-7330-4660，博士，研究員，主要從事作物遺傳育種研究工作，E-mail：hxliu 1965@sina.com

第一作者：賁蓓倍（1995-），http：//orcid.org/0000-0003-3862-4444，研究方向為作物遺傳育種，E-mail：1073195427@qq.com