小白菜AMT1;2基因克隆、組織表達特性檢測及功能驗證

劉建國 郭克婷 肖艷輝 林浴霞 朱云娜

摘要：【目的】克隆小白菜銨轉運蛋白基因（BcAMT1;2），檢測其組織表達特異性并驗證其功能，為深入探究BcAMT1;2基因在小白菜NH4+吸收和轉運過程中的作用機制提供理論參考。【方法】以小白菜品種上海青為材料，采用同源克隆方法克隆BcAMT1;2基因，通過對其編碼蛋白進行生物信息學分析，采用實時熒光定量PCR檢測BcAMT1;2基因組織表達模式，并在擬南芥中超表達該基因以驗證其功能。【結果】克隆的BcAMT1;2基因cDNA序列全長為1539 bp，編碼512個氨基酸殘基，蛋白分子量為54.90 kD，理論等電點（pI）為8.03，無信號肽，有9個跨膜結構域，定位于細胞膜上，為穩定的兩性蛋白。BcAMT1;2蛋白歸屬于AMT1亞家族，具有AMT1的特征結構域（DFAGSGVVHMVGGIAGLWGALIEGPR），與擬南芥AtAMT1;2蛋白的氨基酸序列相似性最高，為91.21%。BcAMT1;2基因在葉片中的表達量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），根和葉柄次之，而在莖中幾乎不表達。在0.25 mmol/L NH4+處理下，超表達BcAMT1;2基因的3個擬南芥株系的生物量（地上部鮮重和地下部鮮重）、主根長度和植株內NH4+-N含量較野生型均顯著增加，而在20 mmol/L甲基胺（MeA）下，超表達BcAMT1;2基因的3個株系的株鮮重較野生型顯著降低，且表現出植株葉片黃化、根系生長受抑等毒害效應。【結論】BcAMT1;2基因具有明顯的組織表達特異性，可調控NH4+及其類似物甲基胺的吸收和轉運，表明BcAMT1;2蛋白在小白菜對NH4+的吸收和轉運過程中發揮著重要作用。

關鍵詞： 小白菜;銨轉運蛋白（AMT）;基因克隆;生物信息學分析;功能驗證

中圖分類號： S634.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）11-2932-09

Molecular cloning，tissue expression specificity detection and functional analysis of AMT1;2 from Chinese cabbage Pak-Choi

LIU Jian-guo， GUO Ke-ting， XIAO Yan-hui， LIN Yu-xia， ZHU Yun-na*

（Henry Fok College of Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan， Guangdong? 512005， China）

Abstract：【Objective】In this paper，an ammonium transporter gene BcAMT1;2 was cloned from Chinese cabbage Pak-Choi，its bioinformatics and tissue expression characteristics were detected， and its function was analyzed， which provi-ded a the oretical basis for further studying the mechanism of BcAMT1;2 gene in NH4+ absorption and transportation in Chinese cabbagePak-Choi.【Method】Homologous cloning method was applied to clone BcAMT1;2 gene from Chinese cabbage Pak-Choi variety Shanghaiqing，then its biological information was carried out on its encoded protein. The expression of BcAMT1;2 gene was detected by real-time fluorescence quantitative PCR in different tissues of Chinese cabbage Pak-Choi，and the function of BcAMT1;2 was verified by overexpression BcAMT1;2 in Arabidopsis thaliana. 【Result】The open reading frame（ORF） of BcAMT1;2 gene was1539 bp，encoding 512 amino acids residues，with molecular weights of 54.90 kD，and theoretical isoelectric points （pI） of 8.03. In addition，BcAMT1;2 protein had no signal peptide，but had 9 transmembrane domains. Stability prediction indicated that BcAMT1;2 was stable amphipathic protein，and the subcellular localization prediction showed BcAMT1;2 might locate in the plasmalemma. Conserved domain analysis suggested that? BcAMT1;2 included the motif （DFAGSGVVHMVGGIAGLWGALIEGPR），which was the signature motif of AMT1 subfamily. Moreover，amino acid sequence alignment showed that BcAMT1;2 protein had the highest homology with AtAMT1;2 （91.21%） in A. thaliana，so BcAMT1;2 was one member of AMT1 subfamily. The expression level of BcAMT1;2 in leaf was significantly higher than in other tissues in Pak-Choi（P<0.05， the same below），followed by the ones of root and petiole，but almost no expression in stem. Under the treatment of 0.25 mmol/L NH4+，the biomass（the fresh weight of root and shoot），the length of primary root，and NH4+-N content of the whole plants were significantly increased in three lines of overexpressing BcAMT1;2，compared with the ones of wild type. At 20 mmol/L methylamine（MeA），the biomass of three lines of overexpressing BcAMT1;2 was significantly lower than that of wild type，with yellow leaves，short roots，and other symptoms of ammonia toxicity. 【Conclusion】BcAMT1;2 gene has obvious tissue specificity and can regulate the absorption and transportation of NH4+ and its analog methylamine， indicating that BcAMT1;2 protein may play an important role in the absorption and transport of NH4+ in Pak-Choi.

Key words： Chinese cabbage Pak-Choi; ammonium transporter （AMT）; gene cloning; bioinformatics analysis;functional verification

Foundation item： Guangdong Natural Science Foundation（2019A1515011680）; Education Department Project of Guangdong（2019KTSCX164）; Doctoral Research Startup Project of Shaoguan University （99000613）

0 引言

【研究意義】硝態氮（NO3-）和銨態氮（NH4+）是植物從土壤吸收的主要無機氮源，對作物生長發育和產量構成極為重要，其中，NO3-是旱作土壤中氮的主要形式，NH4+是水淹或酸性土壤中氮的主要形式（李靜等，2012）。但在農業生產中，無論是何種土壤類型，施用氮肥均會導致NH4+在短期內成為主要形式（Xu and Takahashi，2020）。由于NH4+在同化和利用過程中消耗能量較NO3-少，故NH4+被認為是優勢氮源（Socci and Templer，2011）。但吸收過量NH4+會導致毒害效應，如葉片變黃、生長受抑等。因此，將從土壤吸收的NH4+保持在適宜范圍內對植物的生長尤為重要。植物主要通過銨轉運蛋白（Ammonium transporter，AMT）吸收和轉運NH4+（Yuan et al.，2007;Hao et al.，2020）。因此，克隆AMT基因，分析其生物學功能，對提高小白菜氮素利用率及其分子育種具有重要意義。【前人研究進展】目前，已從水稻（Sonoda et al.，2003）、擬南芥（Loqué et al.，2006）、玉米（Gu et al.，2013）、海棠（Li et al.，2017）、芥藍（Song et al.，2017）、番茄（Filiz and Akbudak，2020）等多種植物中克隆獲得AMT基因。植物AMT蛋白分為AMT1和AMT2兩個亞家族。擬南芥的AMT1亞家族有5個成員，AMT2亞家族有1個成員（Yuan et al.，2007）。其中，AMT1亞家族成員具有不同表達特性，如AtAMT1;1、AtAMT1;2、AtAMT1;3和AtAMT1;5蛋白主要負責擬南芥根系對NH4+的吸收（Yuan et al.，2007）;AtAMT1;4蛋白主要負責花粉對NH4+的吸收，從而調控花粉的氮營養（Yuan et al.，2009）。AtAMT1;1和AtAMT1;3蛋白對底物親和性較高，負責吸收60%～70%的NH4+，AtAMT1;5蛋白負責吸收約10%的NH4+（Yuan et al.，2007）;AtAMT1;2蛋白對底物親和性較低，負責吸收18%～26%的NH4+，且將質外體途徑中的NH4+跨膜轉運至維管束中（Yuan et al.，2007;Straub et al.，2017），也可將氮分配于地上部（Duan et al.，2018）。但八棱海棠中的MrAMT1;2基因在根系中高特異性表達，其編碼蛋白對底物的親和系數較高;MrAMT1;1和MrAMT1;3基因在根、葉等營養器官中均有表達，其編碼蛋白對底物的親和性均低于MrAMT1;2（Li et al.，2017）。可見，不同植物的AMT均對NH4+的吸收和轉運發揮重要作用，但不同AMT家族成員的作用存在差異。【本研究切入點】目前鮮見有關小白菜AMT基因克隆及表達分析的研究報道。【擬解決的關鍵問題】克隆小白菜AMT1;2基因（BcAMT1;2）全長序列，對其生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其組織特異性，并進行功能驗證，以期解析小白菜NH4+吸收轉運過程中的生物學功能，為深入研究小白菜AMT1;2蛋白對NH4+吸收轉運的分子調控機制及小白菜氮素營養研究提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試小白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino），品種為上海青（由河北省青縣純豐蔬菜良種繁育場繁育），種植于廣東省韶關市韶關學院生態園溫室。擬南芥Columbia-0（簡稱Col-0）為野生型。主要試劑：Eastep? Super總RNA提取試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司;PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、Prime STAR Max DNA Polymerase、TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）和pMD20-T載體均購于寶生物工程（大連）有限公司;Clone Express?II One Step Cloning Kit、DNA凝膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α和農桿菌GV3101購于上海唯地生物技術有限公司。超表達載體為pCIAMBIA3301為韶關學院英東生物與農業學院實驗室保存。主要儀器設備：GelDoc XR凝膠成像系統（Bio-Rad，美國）、CFX connect TM Real-time PCR Detection System（Bio-Rad，美國）、T100 PCR儀（Bio-Rad，美國）、Nano-300微量分光光度計（杭州奧盛儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品采集 種子用2.5% NaClO消毒10 min，用蒸餾水沖洗4～5次，采用珍珠巖穴盤育苗，播種后15 d移栽，用1/2 Hoagland營養液進行培養25 d后，取根、莖、葉、葉柄等組織，分別用液氮速凍，放在-80 ℃冰箱中保存備用。

1. 2. 2 總RNA提取及cDNA合成 采用Eastep? Super植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA第一鏈。

1. 2. 3 基因克隆及陽性克隆鑒定 從NCBI數據庫搜索白菜AMT基因序列信息，得到注釋基因AMT1;2（XM_009113156.3）。根據其核苷酸序列，利用Pri-mer 5.0設計AMT1;2基因的特異引物（表1）。反應體系20.0 μL，2×Prime STAR Max Premix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（A12）各1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：98 ℃預變性3 min，98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.0 min，進行35個循環，72 ℃ 5 min。擴增產物回收后連接至pMD20-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經菌落PCR鑒定后，挑取陽性克隆送廣州擎科生物技術有限公司測序。

1. 2. 4 生物信息學分析 將測序結果提交至NCBI數據庫，利用BLASTn在線工具進行對核苷酸序列檢索比對。利用MEGA 6.0進行多重比對和系統發育進化樹構建。利用ProtParam在線預測編碼蛋白的理化性質;以ProtScale分析蛋白的親疏水性;通過SOPMA在線分析蛋白的二級結構，借助Phyre2對蛋白的三級結構進行預測，并以Singal 4.1預測其信號肽;采用Protter進行跨膜結構域預測;采用Wolf Psort進行亞細胞定位;利用WEBLOGO對蛋白的保守結構域進行分析。

1. 2. 5 qRT-PCR檢測 參照植物總RNA提取試劑盒說明分別提取小白菜根、莖、葉柄和葉片組織總RNA。參照PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明去除gDNA并反轉錄合成cDNA第一鏈，用RNase-Free ddH2O稀釋10倍后作為模板，按照TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行qRT-PCR檢測。反應體系為：2×TB Green TaqTM 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（表1）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，RNase Free H2O補充至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環。每個樣品重復3次。以GADPH和Actin作為內參基因，采用2-??Ct計算基因的相對表達量，統計分析用t檢驗。

1. 2. 6 功能驗證 利用Clone Express?II One Step Cloning Kit將BcAMT1;2基因cDNA序列連接至植物表達載體pCAMBIA3301，轉化農桿菌GV3101后，然后浸染擬南芥Col-0的花序，通過轉基因篩選獲得T2代種子，用于功能驗證。擬南芥種子用2.5% NaClO消毒10 min后，用無菌水沖洗5遍，播種于1/2劑量改良Murashige & Skoog培養基上（MS，氮源為4 mmol/L NaNO3，pH 6.0）進行預培養。生長環境條件：光照條件下25 ℃/黑暗條件下23 ℃;光周期為光照16 h/黑暗8 h。預培養4 d后，挑選整齊一致幼苗移至含不同N源[0.25 mmol/L NH4+、20 mmol/L甲基胺（MeA）]的方形培養皿（長×寬×高為10 cm×10 cm×1.5 cm）中生長，移植后10～14 d觀察擬南芥野生型（WT）和轉基因植株的表型和生長情況，測定其生物量、主根長和植株內NH4+-N含量等指標。

1. 3 統計分析

利用Excel 2010進行數據整理，利用SPSS 19.0進行Duncan’s顯著性分析，利用SigmaPlot 11.0進行作圖。

2 結果與分析

2. 1 基因克隆及序列分析結果

利用同源克隆方法，以小白菜cDNA為模板進行擴增，獲得一條約1500 bp的條帶（圖1）。測序結果顯示，該片段長度為1539 bp，將其提交至NCBI數據庫進行比對分析，結果顯示該片段與擬南芥AtAMT1;2基因的相似性為85.85%，與油菜BnAMT1;2的相似性達99.61%，表明該片段為小白菜的AMT1;2基因，縮寫為BcAMT1;2。

2. 2 理化性質預測結果

ProtParam預測結果顯示，BcAMT1;2基因編碼512個氨基酸殘基，由20種氨基酸組成，其中甘氨酸（Gly）含量最高（占11.5%），半胱氨酸（Cys）含量最低（占1.6%）;帶正電氨基酸殘基數為32個，帶負電氨基酸殘基數為30個;BcAMT1;2蛋白的分子量為54.90 kD，理論等電點（pI）為8.03，原子組成為C2518H3792N640O702S20。BcAMT1;2蛋白的不穩定系數為24.28，為穩定蛋白。ProtScale預測結果（圖2）顯示， BcAMT1;2蛋白既有疏水區，也有親水區，為兩性蛋白。Protter預測結果（圖3）顯示，BcAMT1;2蛋白為跨膜蛋白，共有9個跨膜區，其中，N端位于細胞膜外側，而C端位于細胞膜內側，為跨膜蛋白。Wolf Psort預測結果顯示，BcAMT1;2蛋白定位于細胞膜上。通過SignalP 4.0預測分析，發現BcAMT1;2蛋白無信號肽序列（圖4），說明該蛋白為非分泌型蛋白。

2. 3 二、三級結構預測結果

SOPMA預測結果（圖5）顯示，BcAMT1;2蛋白的二級結構由42.97%的α-螺旋（Alpha helix）、20.51%的β-折疊（Extended strand）、4.88%的β-轉角（Beta turn）和31.64%的隨機卷曲（Random coil）組成。Phyre2對蛋白三級結構的預測結果（圖6）顯示，BcAMT1;2蛋白主要部分為α-螺旋，與二級結構的預測結果一致。此外， BcAMT1;2與擬南芥AtAMT1;2的三級結構也較相似（圖6），推測兩者具有相似的生物學功能。

2. 4 多重比對和系統進化分析

將BcAMT1;2、擬南芥AtAMT1;2、番茄LeAMT1;2、煙草NtAMT1;2和水稻OsAMT1;2進行氨基酸序列多重比對分析，結果如圖7所示。BcAMT1;2蛋白與其他植物AMT1;2蛋白均含有保守結構域。基于不同植物AMT1;2氨基酸序列的相似性構建系統發育進化樹，結果（圖8-A）顯示，植物AMT蛋白可分為兩大基因亞家族，即AMT1和AMT2;各類群物種的AMT1或AMT2間的蛋白親緣關系較近，其中，BcAMT1;2蛋白與同為十字花科植物的擬南芥AtAMT1;2蛋白的親緣關系最近，二者氨基酸序列的相似性為91.21%。

利用WEBLOGO分別對AMT1和AMT2亞家族成員的氨基酸序列進行分析，結果表明AMT1成員中包含1個保守結構域（D214-F-A-G-S-G-V-V-H-M（L）-V-G-G-I（V）-A-G-L-W（G）-G-A-L（F）-I（V）-E-G-P-R239）、AMT2成員包含另一個保守結構域（D214-Y（F）-S（A/G）-G-G-Y-V-I-H-L（V）-S-S（A）-G-V（I）-A-G-F（L/V）-T（V）-A（T）-A-Y-W-V-G-P-R239）（圖8-B），均為AMT特征結構域。

2. 5 BcAMT1;2基因在小白菜不同組織特異性分析

由圖9可知，BcAMT1;2基因在小白菜不同組織中均有表達，但其表達水平存在明顯差異。BcAMT1;2基因在小白菜葉片中的相對表達量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），在根中的相對表達量次之，而在莖中幾乎不表達，表明BcAMT1;2基因表達具有明顯的組織特異性。

2. 6 BcAMT1;2基因功能驗證結果

將BcAMT1;2基因導入農桿菌GV3101后，侵染擬南芥花序，通過篩選獲得T2代超表達BcAMT1;2基因擬南芥植株。從圖10-A可看出，與野生型（WT）相比，超表達BcAMT1;2基因的3個株系12-4、12-6和12-9的地上部鮮重和地下部鮮重均顯著增加，增幅分別為11.3%～16.5%和33.3%～37.3%（圖10-A和圖10-B），且主根長度和植株內NH4+-N含量也顯著增加，增幅分別為7.5%～12.8%和17.9%～32.0%（圖10-C和圖10-D）。

MeA為NH4+的有毒化學類似物，過量吸收可造成細胞死亡（叢郁等，2013）。通過MeA敏感性試驗發現，與野生型相比，超表達BcAMT1;2基因的3個株系植株鮮重顯著降低（圖11-A和圖11-B），植株葉片黃化、根系生長受抑等毒害效應，表明超表達BcAMT1;2基因可促進擬南芥對MeA的吸收。

終上所述，擬南芥中超表達BcAMT1;2基因可增加植株體內NH4+-N含量，推測BcAMT1;2與擬南芥AtAMT1;2蛋白在NH4+的吸收和轉運過程中具有相似生物學功能（Yuan et al.，2007）。

3 討論

本研究利用同源克隆方法從小白菜中獲得BcAMT1;2基因，cDNA全長序列1539 bp，編碼512個氨基酸殘基，定位于細胞膜上，符合植物銨轉運蛋白為膜蛋白的基本特征（Loqué and Von Wirén，2004;Mcdonald et al.，2012）。BcAMT1;2蛋白具有9個跨膜結構域，與Ye等（2016）報道的AMT蛋白一般包含9～12個跨膜結構域的結論基本一致。AMT1和AMT2基因亞家族分別含有各自的保守結構域，位于第5個或第6個跨膜區上（Saier，1998），保守的特征結構域可用于鑒別其他植物AMT亞家族成員（Couturier et al.，2007），而BcAMT1;2在第5個跨膜區包含“DFAGSGVVHMVGGIAGLWGALIEGPR”，具有植物AMT1亞家族的特征結構域，表明BcAMT1;2屬于AMT1亞家族。此外，BcAMT1;2蛋白與擬南芥AtAMT1;2的氨基酸序列相似性最高，為91.21%，且二者具有相似的三級結構，推測BcAMT1;2具有與擬南芥AtAMT1;2蛋白相似的生物學功能。

不同植物AMTs基因在不同組織部位的表達模式不同。擬南芥AtAMT1;2基因在根和葉中均有表達，而AtAMT1;3基因在根系特異表達（Yuan et al.，2007）;在八棱海棠中，MrAMT1;1和MrAMT1;3基因在根和葉中均有表達，而MrAMT1;2基因在根系特異表達（Li et al.，2017）;CsAMT1;2基因在茶樹根部特異表達而在葉片幾乎不表達（張文婧等，2020）。本研究結果顯示，BcAMT1;2基因在葉片中表達最強，在根中表達次之，而在莖和葉柄中表達微弱。這與番茄（von Wirén et al.，2000）、油菜（Pearson et al.，2002）、擬南芥（Yuan et al.，2007）中的結果相似，推測AMT在葉片中高表達可能與植物氮素循環再利用有關，但與八棱海棠MrAMT1;2基因（Li et al.，2017）、茶樹CsAMT1;2基因（張文婧等，2020）的表達特性不同。可見，不同物種AMT同源基因表達特性也存在差異，可能與不同物種的同源基因在適應環境時進化出的不同生理功能有關（Li et al.，2017）。

為進一步驗證BcAMT1;2基因的功能，本研究在擬南芥中超表達該基因。在0.25 mmol/L NH4+處理下，與野生型相比，超表達BcAMT1;2基因顯著提高擬南芥植株體內NH4+-N含量，且增加主根長度和植株生物量;與野生型相比，超表達BcAMT1;2基因促進擬南芥對銨類似物MeA的吸收。由此可見，本研究克隆的BcAMT1;2基因編碼蛋白具有轉銨功能。這與Yuan等（2007）、Duan等（2018）的研究結果一致。除NH4+是AMT的轉運底物外，NH3也是其轉運底物。Neuh?user和Ludewig（2014）利用電化學技術證明擬南芥AtAMT1;2還具有NH3/H+共轉運功能，通過改變NH3和H+轉運耦合而影響NH3的轉運，在不同H+耦合比例下，AMT/Rh蛋白可能具有通用的NH3轉運機制。今后還需通過構建BcAMT1;2超表達或基因敲除的小白菜轉基因植株，進一步研究AMT在NH4+/NH3的吸收和轉運過程中的作用及分子機制，為研究植物對NH4+/NH3的吸收和轉運的調控提供理論參考。

4 結論

BcAMT1;2基因具有明顯的組織表達特異性，可調控NH4+及其類似物甲基胺的吸收和轉運，表明BcAMT1;2在NH4+的吸收和轉運過程中發揮著重要作用。

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收稿日期：2021-02-02

基金項目：廣東省自然科學基金項目（2019A1515011680）;廣東省教育廳項目（2019KTSCX164）;韶關學院博士科研啟動項目（99000613）

通訊作者：朱云娜（1982-），https：//orcid.org/0000-0001-5849-3598，博士，主要從事蔬菜生理與分子生物學研究工作，E-mail：zhuyn326@126.com

第一作者：劉建國（1981-），https：//orcid.org/0000-0001-5095-6412，主要從事園藝生理生態研究工作，E-mail：jgliu@sgu.edu.cn