雙歧桿菌在嬰兒配方奶粉中的穩定性研究

文/蕭婷婷 吳 穎 陳方圓 劉 內

（湖南歐比佳營養食品有限公司）

雙歧桿菌是從嬰兒糞便中分離出來的一種革蘭氏陽性專性厭氧菌，是人體重要的益生菌，可以有效調節嬰幼兒腸道微生態，具有改善喂養不耐受，增強嬰幼兒機體免疫力的功能，能有效預防和治療腹瀉并緩解過敏癥狀[1～5]。

嬰兒配方奶粉中雙歧桿菌活菌存活率受溫度、水分活度等因素影響，活菌數會隨著儲存時間的增長而下降[6～8]，從而影響產品貨架期。《GB 10765—2010食品安全國家標準 嬰兒配方食品》規定添加益生菌的嬰幼兒配方食品在貨架期內活菌數要≥1.0×106CFU/g[9]。現市售奶粉貨架期大多為兩年，目前對于雙歧桿菌在奶粉中的穩定性研究試驗周期均較短[6～8，10]，對于雙歧桿菌奶粉產品貨架期內產品穩定性還需要進一步的研究。本文將添加定量動物雙歧桿菌Bb-12的嬰兒配方奶粉放置在不同的存儲環境中進行6 個月的加速試驗和24 個月的長期試驗，通過測定水分含量、水分活度和活菌數，研究貨架期內活菌數的穩定性情況，為添加雙歧桿菌的產品貨架期的確認提供依據。

1 材料與方法

1.1 原料

菌種：動物雙歧桿菌Bb-12購自丹麥科·漢森有限公司，活菌數≥3.0×1010CFU/g。

嬰兒配方奶粉：800 g充氮罐裝（殘氧量≤3%），其中動物雙歧桿菌Bb-12添加量為500 mg/kg。

培養基：MRS培養基。

1.2 主要儀器設備

恒溫恒濕箱、電子天平、厭氧培養箱、無菌超凈工作臺、水分活度測定儀、電熱恒溫干燥箱。

1.3 檢測方法

1.3.1 活菌數的測定

取25 g奶粉到225 mL無菌稀釋液混勻，制成1：10的樣品勻液。取1 mL之前配制的1：10樣品勻液到9 mL無菌稀釋液中，混勻成1：100的樣品勻液，如此制備10 倍系列稀釋樣品勻液。選擇2～3 個連續稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于兩個滅菌平皿內，同時做稀釋液的空白對照，然后及時將46℃的培養基傾注平皿混勻。凝固后于（36±1）℃培養箱厭氧培養48～72 h。培養后計數平板上的所有菌落數。

1.3.2 水分活度的測定

稱取約1 g（精確至0.01 g）試樣，迅速放入樣品皿中，封閉測量倉，在20～25 ℃，相對濕度50%～80%的條件下測定，每隔5 min記錄水分活度儀的響應值。當相鄰兩次響應值之差小于0.005 Aw時，即為測定值，儀器充分平衡后，同一樣品重復測定3 次。當符合精密度所規定的要求時，取兩次平行測定的算術平均值作為結果。

表1 長期試驗和加速試驗過程中水分含量的變化

1.3.3 水分含量的測定

取潔凈的稱量瓶， 置于101～105 ℃的干燥箱中，平蓋斜支于瓶邊，加熱1 h，取出蓋好，置于干燥器內冷卻0.5 h，稱量，并重復干燥至前后兩次質量差不超過2 mg，恒重。稱取3 g奶粉（精確至0.0001 g），放入此稱量瓶中，試樣厚度不超過5 mm，如為疏松試樣，厚度不超過1 0 mm，再將稱量瓶放入101～105℃干燥相中，瓶蓋斜支于瓶邊，干燥2～4 h后，蓋好取出，放入干燥器內冷卻0.5 h后稱量。然后再放入101～105 ℃干燥箱中干燥1 h作用，取出，放入干燥器內冷卻0.5 h后再稱量。并重復以上操作至前后兩次質量差不超過2 mg，恒重。

1.4 試驗原理及方法

1.4.1 長期試驗方法

將添加動物雙歧桿菌Bb-12的真空充氮包裝（殘氧≤3%）的8 0 0 g 聽罐試驗樣品放置常溫常濕實驗室。在放置0 個，3個，6 個，9 個，12 個，18 個和24 個月后，取樣檢測分析樣品的水分含量、水分活度和雙歧桿菌活菌數。

1.4.2 加速試驗原理及方法

加速試驗中，為避免溫度過高加快奶粉中蛋白質變性、脂肪氧化、美拉德反應等，實驗溫度選取（40±2） ℃。根據Arrhenius經驗公式，即K[T+10℃]/K[T]=2（式中K為反應速度常數），反應溫度每升高10 ℃，化學速率升高1 倍，且反應速度常數與食品貨架壽命成反比，即反應速度常數越大，貨架壽命越短。則（40±2） ℃加速6 個月相當于（20±2） ℃條件下存放24個月。

取添加動物雙歧桿菌Bb-12的真空充氮包裝（殘氧≤3%）的800 g聽罐試驗樣品放置在恒溫恒濕箱中，設置實驗條件為：溫度（40±2） ℃，濕度（75±5）%RH。在放置0 個，1 個，2 個，3個，6 個月后，取樣檢測分析樣品的水分含量、水分活度和雙歧桿菌活菌數。

2 結果與討論

2.1 長期試驗和加速試驗過程中水分含量的變化

水分含量是奶粉重要的質量指標之一，國家標準要求嬰配粉中水分含量必須控制在5%以下。當奶粉中水分含量過高時，易造成奶粉結塊，引發微生物滋長， 導致產品變質。由表1 數據分析，水分含量在長期試驗和加速試驗過程中整體變化幅度不大， 含量分別為（2.5 6±0.1 3）%、（2.44±0.06）%，所有檢測數據均符合GB 10765要求。在加速試驗的高濕（75±5）% RH環境下，水分含量與長期試驗無較大差異，側面說明該產品選用的馬口鐵罐包裝材料阻隔性很好，外界環境未能對罐內奶粉產生影響，能更好地保證產品質量。

表2 長期試驗和加速試驗過程中水分活度的變化

表3 長期試驗和加速試驗儲存過程中活菌數的變化

2.2 長期試驗和加速試驗過程中水分活度的變化

水分活度是影響益生菌穩定性的主要因素。水分活度越高，益生菌穩定性越差，當水分活度控制在0.20 Aw以下時，活菌數衰減率最低[6，7]。由表2結果可知，在儲存過程中水分活度隨儲存時間的延長基本穩定。長期24 個月試驗和加速6 個月試驗水分活度檢測值的變異系數分別為0.56%和0.49%，說明試驗期間水分活度相對穩定。但試驗中產品的水分活度最小為0.322，較益生菌奶粉理想水分活度（0.2以下）[10]略高，這可能會對產品中的動物雙岐桿菌活菌數穩定性造成一定的影響。

2.3 長期試驗和加速試驗儲存過程中活菌數的變化

益生菌產生效果的重要保證是益生菌的活菌數量。當益生菌的活菌數大于1.0×106CFU/g時，即可滿足嬰幼兒從產品中攝入的雙歧桿菌活菌有效劑量。由表3數據可知，雙歧桿菌活菌數在長期試驗和加速試驗下有不同程度的衰減。加速試驗期間，從原來的2.14×107CFU/g下降到了1.42×107CFU/g，雙歧桿菌活菌數衰減了33.64%，活菌數數量級沒有變化。在長期試驗中，存放12個月后雙歧桿菌活菌數衰減了40.52%，即由2.32×107CFU/g下降至1.38×107CFU/g；試驗結束時雙歧桿菌活菌數較最初衰減了53.02%，下降趨勢較明顯，但活菌數數量級依舊沒有改變，為1.09×107CFU/g。長期試驗的最終結果與齊曉彥[6]等的研究發現（當水分活度大于0.25時活菌數存活率為50%）接近。由試驗數據說明，雙歧桿菌活菌數經過長期24 個月和加速6 個月的試驗后，均有一定程度的衰減，但是活菌數量級保持不變，整體穩定性良好，其活菌數仍遠大于1.0×106CFU/g，符合GB 10765要求。

3 結論

動物雙歧桿菌Bb-12添加量為500 mg/kg的嬰兒配方奶粉經干法混合，充氮罐裝（殘氧量≤3%）成800 g聽裝成品后，在加速試驗（40±2）℃，（75±5）%RH條件下放置6個月，雙歧桿菌活菌數檢測結果由2.14×107CFU/g下降至1.42×107CFU/g，活菌數數量級沒有降低，衰減率為33.64%。長期試驗（常溫、常濕）條件下放置24 個月，雙歧桿菌活菌數檢測結果由2.32×107CFU/g下降至1.09×107CFU/g，衰減率為53.02%，活菌數數量級沒有變化，整體穩定性良好，符合國家標準要求。試驗證明，動物雙歧桿菌Bb-12在嬰兒配方奶粉保質期（2年）內質量穩定。