基因片段掃描檢測(cè)T細(xì)胞受體多樣性運(yùn)用于益艾康膠囊治療艾滋病的效果觀察*

李 杰，桑 鋒，鄧博文，岳靜宇，李 強(qiáng)，郭會(huì)軍

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心 河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000)

人類免疫缺陷病毒 (human immunodeficiency virus，HIV)主要侵犯人體CD4+T細(xì)胞，破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，在此過程中T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)多樣性同樣遭到破壞。中藥具有多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)調(diào)控的特點(diǎn)，在防治復(fù)雜、慢性疾病方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。益艾康膠囊 (由人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、川芎、白芍、黃芩等組成) 是一種通過調(diào)節(jié)免疫治療艾滋病的中藥制劑，可以穩(wěn)定和提高HIV患者CD4+T細(xì)胞數(shù)量[1]，但對(duì)TCR多樣性有無影響尚不完全清楚。TCR多樣性能夠反映機(jī)體免疫系統(tǒng)狀態(tài)，近年來對(duì)其的檢測(cè)逐漸被運(yùn)用于淋巴瘤的診斷[2]，但其在艾滋病研究中的運(yùn)用，目前國內(nèi)報(bào)道較少。常用的TCR多樣性檢測(cè)方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，其原理是利用免疫球蛋白或TCR基因重排過程中V-D-J區(qū)互相靠攏的特征，設(shè)計(jì)通用引物在一定范圍內(nèi)擴(kuò)增出特征性基因片段[3]?；蚱螔呙枋且环N比較精確的片段分析技術(shù)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳掃描識(shí)別不同熒光信號(hào)，通過數(shù)據(jù)分析軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)分析。它不僅能自動(dòng)顯示出擴(kuò)增產(chǎn)物的清晰峰形，還能得到各產(chǎn)物片段大小和強(qiáng)度的具體數(shù)值，且能夠從峰形、曲線下面積、離散度等方面較為全面地評(píng)估TCR多樣性變化情況。本研究將TCR β鏈的互補(bǔ)決定區(qū)3(complementarity-determining region 3,CDR3)基因多樣性檢測(cè)運(yùn)用于益艾康膠囊治療艾滋病的臨床觀察中，探討該方法運(yùn)用的可行性、局限性等問題。

1 材料與方法

1.1 樣 本

從河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院艾滋病臨床研究中心樣本儲(chǔ)存庫保存的河南省中醫(yī)藥治療艾滋病試點(diǎn)項(xiàng)目樣本中，選取40例益艾康膠囊治療HIV/AIDS 1年的全血樣本作為益艾康膠囊組；另外采集17例健康者(均簽署知情同意書)血液樣本作為健康對(duì)照組。

1.2 試劑與儀器

血液基因組DNA提取試劑盒(規(guī)格50 T，批號(hào)27121)、PCR預(yù)混液(無染料,2×Taq MasterMix,規(guī)格5 mL,批號(hào)150911)，均為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；去離子甲酰胺(Hi-Di，規(guī)格5 mL,批號(hào)81234347)、分子量?jī)?nèi)標(biāo)(Liz-500，規(guī)格500 assay，批號(hào)1212339)、液體分離膠(Pop-7，規(guī)格5 mL，批號(hào)1612138)、電泳緩沖液(10 ×，規(guī)格25 mL，批號(hào)1606477)，均為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。C1000 touch PCR儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品；3130 XL測(cè)序儀,Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.3 方 法

1.3.1 全血基因組DNA提取

①取1 mL全血放入 1.5 mL EP管中，加入 400 μL 裂解液1渦旋15 s后， 8 000 r/ min 離心1 min，棄上清液，重復(fù)1次；加入1 mL 裂解液 2，上下翻轉(zhuǎn)，渦旋后8 000 r/ min 離心1 min， 棄上清液，重復(fù)1 次。②加入蛋白酶K 10 μL，反復(fù)吹打， 再加入 320 μL消化液，58 ℃水浴中消化 15 min。③加入 110 μL純化液， 15 000 r/ min 離心1 min，吸出上清液，放入加有1 mL無水乙醇離心管中，上下翻轉(zhuǎn)可見絮狀DNA析出。 ④將液體轉(zhuǎn)入離心柱中，8 000 r/ min 離心 1 min，棄濾液。⑤加入 200 μL 體積分?jǐn)?shù)為700 mL/L乙醇于濾柱內(nèi)， 8 000 r/ min 離心 1 min， 棄濾液。⑥將離心柱放入潔凈EP管中，加入 100 μL水，靜置10 min后 8 000 r/ min 離心 1 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 設(shè)計(jì)合成熒光引物與PCR

引物組合見表1。反向引物均用FAM標(biāo)記，由生工生物技術(shù)公司合成。混合引物時(shí)每條引物終濃度為10 nmol/L。 PCR反應(yīng)體系 50 μL，包括：2×PCR Mix (無染料)25 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，模版30 ng，補(bǔ)水至 50 μL。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性 10 min，94 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸 30 s， 40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。

1.3.3 TCR β鏈基因重排檢測(cè)

2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶于8 μL Hi-Di,加入96孔裙邊板中，每孔加入0.5 μL Liz-500，95 ℃孵育 2 min，-20 ℃冷卻后上機(jī)檢測(cè)，采用 Pop-7液體膠，50 cm 毛細(xì)管在3130 XL 測(cè)序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，選擇片段分析模塊收集數(shù)據(jù)。

1.3.4 掃描數(shù)據(jù)分析

采用 GeneMapperID-X軟件進(jìn)行片段掃描數(shù)據(jù)分析，以目標(biāo)片段區(qū)域的曲線下面積和、擴(kuò)增峰離散度及峰形圖譜等指標(biāo)表示TCR種類和數(shù)量，分析 TCR β 鏈可變區(qū)CDR3 V、D、J區(qū)基因重組變化。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析與處理

采用GeneMapperID-X軟件用于收集數(shù)據(jù)，計(jì)算HIV/AIDS患者目標(biāo)區(qū)域曲線下面積總和作為 TCR β 鏈基因重排多樣性指標(biāo)分析益艾康膠囊治療前、后變化情況。因?yàn)門CR多樣性個(gè)體間差異較大，所以健康對(duì)照組與HIV/AIDS患者組之間的比較不能單純采用曲線下面積和。本研究采用健康者及HIV/AIDS患者目標(biāo)區(qū)域片段四分位間距(P75-P25)表示片段分布的離散率(由于原始數(shù)據(jù)數(shù)量級(jí)較大，分析時(shí)則同比例縮小)，以離散率代表多樣性，分別用以比較HIV/AIDS患者治療前、后與健康者的離散率差異，進(jìn)而反映多樣性差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA質(zhì)量分析

以Liz-500作為分子量標(biāo)志物，通過毛細(xì)管電泳在分子量50～500 bp之間掃描出15條分離清晰的固定分子量標(biāo)記片段，用以判定目標(biāo)片段大小。樣本DNA均可檢測(cè)出300 bp以上擴(kuò)增峰，說明DNA較為完整，可以滿足檢測(cè)需要?？瞻讓?duì)照無擴(kuò)增峰，表明實(shí)驗(yàn)過程中無外源性核酸污染。見圖1。

圖1 Liz-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)物掃描圖譜及內(nèi)標(biāo)曲線

2.2 健康對(duì)照組TCRβ鏈基因重排多樣性掃描峰形圖譜

X軸代表各目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物大小(bp)，Y軸代表目標(biāo)片段相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度；TCR β鏈各管分別在其目標(biāo)區(qū)域出現(xiàn)一系列擴(kuò)增峰，呈現(xiàn)類似鐘形的正態(tài)分布。見圖2。

2.3 HIV/AIDS患者組治療前后TCR β鏈曲線下面積對(duì)比

益艾康膠囊治療前后TCR β鏈 A管和B管曲線下面積對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TCR β 鏈 C管治療前后的曲線下面積對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，治療后αβ T細(xì)胞TCR β鏈D-J區(qū)基因重排片段種類和數(shù)量有所增加，多樣性得到改善。見表2、圖3。

表2 HIV/AIDS患者組治療前后TCR β鏈曲線下面積對(duì)比

圖3 益艾康膠囊治療前后TCR β鏈多樣性增加圖譜

2.4 兩組治療前后TCR β鏈離散度對(duì)比

見表3。HIV/AIDS患者治療前后TCR β鏈各管分別與健康對(duì)照組對(duì)比，離散度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，顯示健康者PCR產(chǎn)物目的片段離散度較小，相比之下更接近正態(tài)分布。A管和B管同管治療前后對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C管治療前后對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 兩組治療前后TCR β離散度對(duì)比

3 討 論

近年來，T細(xì)胞受體V區(qū)基因重排多樣性檢測(cè)被越來越多地運(yùn)用于腫瘤特別是淋巴瘤等疾病的研究中[4-5]。TCR是T細(xì)胞特異性識(shí)別抗原的受體。在同一個(gè)體內(nèi)，TCR組成多樣性極為豐富的TCR庫，賦予個(gè)體對(duì)環(huán)境中各種各樣的病原體(抗原)進(jìn)行識(shí)別和應(yīng)答的巨大潛力。T細(xì)胞受體庫是由V基因片段末端、D基因片段、J基因片段前端及連接時(shí)插入的核苷酸序列等一系列基因片段重排共同組成[6-7]，因此，通過測(cè)定特定基因重排片段出現(xiàn)的頻率可以反映特定T細(xì)胞克隆擴(kuò)增的程度，從而反映T細(xì)胞免疫系統(tǒng)狀態(tài)；此外，分析不同時(shí)間點(diǎn)TCR多樣性變化情況可以動(dòng)態(tài)了解整體T細(xì)胞免疫變化情況。根據(jù)所含肽鏈不同可將TCR分為TCR αβ 和TCR γδ兩種類型。正常人體內(nèi)95%為TCR αβ，少數(shù)為TCR γδ。本研究主要針對(duì)αβ T細(xì)胞中長鏈TCR β鏈基因重排多樣性進(jìn)行檢測(cè)，建立檢測(cè)方法，分析HIV/AIDS患者在益艾康膠囊治療前后的TCR變化情況，為臨床療效觀察提供依據(jù)。

健康者在沒有外來抗原特異性刺激的情況下，機(jī)體αβ T細(xì)胞受體基因片斷處于隨機(jī)重排狀態(tài)，細(xì)胞受體表現(xiàn)為多克隆性，其基因片段掃描后呈現(xiàn)典型的鐘形高斯分布特征，從而保障機(jī)體具有識(shí)別外界多樣性抗原的能力[8]。如果機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重病毒性感染或罹患T細(xì)胞淋巴瘤等，機(jī)體免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)動(dòng)員激活狀態(tài)，TCR基因會(huì)出現(xiàn)寡克隆或單克隆重組表達(dá)，其TCR多樣性出現(xiàn)損害，進(jìn)而導(dǎo)致其他病原體機(jī)會(huì)性感染的增加。

自河南省中醫(yī)藥治療艾滋病試點(diǎn)項(xiàng)目開展以來，益艾康膠囊被廣泛用于HIV/AIDS患者的治療。十余年的臨床實(shí)踐證實(shí)，其能夠改善HIV/AIDS患者的臨床癥狀和體征，提高患者生存質(zhì)量，降低病死率[9-11]。雖然益艾康膠囊有較好的療效，但其作用機(jī)制不甚明了，影響了該藥的推廣，因此探索其作用機(jī)制有重要作用。本研究中，從曲線下面積來看，TCR β鏈A管和B管治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即TCR β鏈V-J重組區(qū)治療前后差別不大；TCR β鏈C管治療前后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明TCR β鏈D-J區(qū)治療后基因重排情況與治療前不同，多樣性得到改善。就片段離散度分析結(jié)果來看，HIV/AIDS患者相比健康者離散度大，正態(tài)性不優(yōu)于健康者。治療后TCR β鏈C管離散度與治療前有所增大(P<0.05)。結(jié)合治療前后曲線下面積總和比較分析可知，雖然治療后TCR β鏈D-J區(qū)基因重排多樣性得到改善，但其離散度比治療前大，可能是主峰位置偏移所致。

TCR β鏈基因重排多樣性可以作為一種新的檢測(cè)手段用于益艾康膠囊治療HIV/AIDS患者的臨床療效觀察。但是，TCR影響因素較多，年齡、所處地區(qū)、心理狀態(tài)等均可能對(duì)機(jī)體免疫功能產(chǎn)生影響，而排除此類因素較為困難，因此，將其在HIV感染患者與健康者之間進(jìn)行比較有一定的局限性，但跟蹤隨訪同一位患者進(jìn)行比較較為可行。同時(shí)，基于HIV感染后機(jī)體的免疫重建機(jī)制， TCR多樣性變化觀察可能是一個(gè)長期的過程。另外，分析該指標(biāo)與T細(xì)胞亞群檢測(cè)和病毒載量的相關(guān)性還需進(jìn)一步探討。