Box-Behnken設計優化陽離子交換色譜分離牛初乳中乳鐵蛋白的工藝研究

劉佳欣，賀夢瑤 ，湯興楠，欒凱雯

（沈陽化工大學制藥與生物工程學院，遼寧 沈陽 110142）

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種鐵結合性糖蛋白，相對分子質量約為 80 kDa[1]，最早是由Sorensen（1939）在牛乳中一個未知的“紅色組分”中發現[2]。乳鐵蛋白在乳中的含量最為豐富，特別是在初乳中含量較高，人初乳中乳鐵蛋白的質量濃度可達到7 mg·mL-1,牛初乳中乳鐵蛋白的質量濃度平均為1 mg·mL-1[3]。

乳鐵蛋白作為多功能糖蛋白具有多種生物活性，抗病毒、抗癌[4]、抗氧化、調節機體免疫反應[5],還具有抑菌功能[6-7]，對腸道菌群的有一定調節作用。目前分離乳鐵蛋白的方法有很多種，如凝膠過濾層析法、膜分離法，親和色譜法[8-10]等。凝膠過濾層析操作簡便所需設備簡單，并且層析所用的凝膠屬于惰性載體，不會影響分離物。但凝膠過濾層析對流速要求較高，且對于分子量相差不多的物質難以達到很好的分離效果[11]。由于LF 的熱穩定性差，而膜分離法是一個不需要加熱，并且不需要化學試劑的分離方法，因此可以最大限度地保持LF 的生物活性，但膜容易堵塞，不易清洗，分離成本高[12-13]。親和色譜法是一種新興的分離技術，該技術通過利用固定相的結合特性實現對分子的分離，抗體與抗原作用專一性高、親和力強，可實現一步分離.但操作費用昂貴，不能用于工業化[14]。本試驗試驗采用陽離子交換色譜CM-Sepharose fast flow 分離牛初乳中的乳鐵蛋白，并對其分離條件進行優化，得到最佳的分離條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

95%乳鐵蛋白，biotopped 公司；牛初乳，木蘭花乳業奶牛養殖場；CM-Sepharose fast flow 5 mL，通用電氣公司；鹽酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，均為分析純，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

AKTA purifier，通用電氣公司；高速冷凍離心機,賽默飛世爾科技有限公司；Synergy2 多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；HH4 型數顯恒溫水浴鍋, 金壇市天瑞儀器有限公司；GB1302 型電子精密天平，梅特勒托利多儀器公司；SHZ-D (Ⅲ)循環水式真空泵，鞏義市予華儀器責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

將牛初乳裝入100 mL 離心管中，以10 000 r·min-14 ℃離心30 min，除去上層脂肪；加入1 mol·L-1的稀鹽酸，緩慢添加調至牛初乳溶液pH 為4.6，水浴加熱40 ℃，保溫30 min，然后放入高速冷凍離心機中，以10 000 r·min-140 ℃離心30 min，保留上層乳清蛋白，將得到乳清蛋白溶液；

進行抽濾，得到的粗樣品，用0.45μm 的微孔濾膜過濾，得到純凈的樣品。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：CM-sepharose fast flow 預裝柱5 mL；流動相：A 溶液（pH 值為7.0，濃度為0.02 mol·L-1的磷酸緩沖鹽溶液）；B 溶液（pH 值為7.0，濃度為1 mol·L-1NaCl 混合溶液）；洗脫速度1 mL·min-1；進樣量: 1 mL，上樣速度1 mL·L-1；紫外檢測器，檢測波長280 nm、475 nm。

1.4 單因素試驗

以起始緩沖液pH7、洗脫液濃度1 mol·L-1、洗脫速度1 mL·min-1、上樣速度1 mL·min-1為基本條件，通過改變單一因素來探討其對乳鐵蛋白得率的影響。起始緩沖液分別為6.0、6.5、7、7.5、8.0；洗脫液濃度0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1、洗脫速度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1; 上樣速度0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1。

1.5 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken 試驗設計原理，采用Design-Expert 軟件，以乳鐵蛋白的得率為影響值進行響應面優化，響應面因素和水平見表1。

表1 響應面因素和水平表

1.6 乳鐵蛋白得率的測定方法

乳鐵蛋白得率（%）=乳鐵蛋白峰面積÷總蛋白峰面積×100%。

1.7 數據分析

所有試驗設置3 次重復，并通過SPSS17.0 軟件統計進行數據方差分析，p＜0.01 差異具有顯著統計學意義，試驗結果用作圖軟件origin9.0 繪圖。

2 結果與分析

2.1 穿透曲線的繪制

標準乳鐵蛋白的在CM-Sepharose fast flow 離子交換色譜上的穿透曲線如圖 1。試驗在流速1 mL·min-1下進樣, 由圖1 可見上樣體積達到1 mL時達到穿透點, 2 mL 左右CM-Sepharose fast flow 離子交換色譜吸附基本達到飽和，之后吸附作用開始減弱，由此計算得到, 進樣2 mL 左右可以使預裝柱充分吸附, 因此確定最大上樣量為100 μg·mL-1。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 起始緩沖液pH 對乳鐵蛋白得率的影響

圖1 CM-Sepharose fast flow 穿透曲線

圖2 起始緩沖液對乳鐵蛋白得率的影響

當起始緩沖液pH 在6.0～6.5 時，乳鐵蛋白得率降低，見圖2，這是因為當起始緩沖液pH 值為6.5時，洗脫時需要高濃度的鹽溶液才可以將乳鐵蛋白洗脫下來，因此乳鐵蛋白得率降低。當起始緩沖液的 pH 為 8.0 時, 乳鐵蛋白基本無法吸附在CM-Sepharose fast flow 色譜柱上，乳鐵蛋白會與部分雜蛋白等組分一起率先被洗脫下來，此時的乳鐵蛋白得率不高[15-16]。

2.2.2 洗脫液濃度對乳鐵蛋白得率的影響

洗脫液NaCl 濃度在0.6～1.0 mol·L-1時，洗脫液濃度越大，乳鐵蛋白得率越高，當洗脫液濃度為 0.8 mol·L-1時乳鐵蛋白得率最高，見圖3。當洗脫液濃度繼續升高，乳鐵蛋白得率下降，這可能是因為少部分乳過氧化物酶被洗脫下來。乳過氧化物酶等電點9.0，高于乳鐵蛋白的等電點，與離子交換介質的相互作用力強于乳鐵蛋白。洗脫液濃度過大，乳過氧化物酶的相互作用力減弱，也被洗脫下來，導致乳鐵蛋白得率降低[17-19]。

2.2.3 洗脫速度對乳鐵蛋白得率的影響

由圖4 可以發現，洗脫速率為 1.0 mL·min-1的情況下，得到乳鐵蛋白得率最高，而低于或高于此濃度的洗脫流速情況下，CM-Sephadrose fast flow 色譜柱吸附乳鐵蛋白的未能及時被洗脫下來，使得乳鐵蛋白得率低。

圖3 洗脫液濃度對乳鐵蛋白得率的影響

圖4 洗脫速度對乳鐵蛋白得率的影響

2.2.4 上樣速度對乳鐵蛋白得率的影響

上樣速率在 0.4～0.8 mL·min-1時，上樣速率對乳鐵蛋白得率無明顯影響，上樣液中的乳鐵蛋白可以充分擴散到CM-Sepharose fast flow 色譜柱表面。上樣速率超過0.8 mL·min-1后，乳鐵蛋白的得率開始下降，這是因為上樣速率過快，樣品中的乳鐵蛋白未及時被離子交換劑表面吸附就從層析柱中沖出，造成乳鐵蛋白流失[20-22]。

圖5 上樣速度對乳鐵蛋白得率的影響

2.3 響應面優化試驗結果

2.3.1 回歸模型的構建及方差分析

乳鐵蛋白分離試驗設計方案以及結果見表2，回歸方差分析見表3，擬合所得多元二次回歸方程Y=84.94+0.33A+0.36B+0.23C+0.14D+0.29AB-0.49A C+0.32AD+0.39CD-2.62A2-2.50B2-1.51C2-0.98D2。

表2 響應面試驗設計和試驗結果

由表3 數據可知，該回歸模型達到極顯著水平（p＜0.01），說明該方法是可靠的；失擬項不顯著，R2=0.987 9，表明此模型的擬合程度良好，乳鐵蛋白得率可以用該模型進行分析和預測。通過對比表3中的F值可以看出，影響乳鐵蛋白得率的主次順序為：B＞A＞C＞D，即洗脫速度＞起始緩沖液pH＞洗脫液濃度＞上樣濃度。

表3 回歸模型方差分析表

2.3.2 各因素之間的交互作用

根據回歸方程做出的各兩因素交互作用的響應面分析圖見圖6。起始緩沖液pH（A）和洗脫速度（B）交互作用對乳鐵蛋白得率的影響顯著。起始緩沖液pH（A）和洗脫液濃度（C）交互作用對乳鐵蛋白的得率的影響顯著。洗脫液濃度（C）和上樣速度（D）交互作用對乳鐵蛋白得率的影響顯著。

2.3.3 最優條件的確定及驗證實驗

用Design-Expert8.06 軟件對二次多項式回歸方程進行計算，得到陽離子交換色譜法分離乳鐵蛋白的最優制備工藝條件為：起始緩沖液pH7.03，洗脫速度1.01 mL·min-1, 洗脫液濃度1.01 mol·mL-1, 上樣速度0.82 mL·min-1, 乳鐵蛋白得率的理論最優值為84.98%。參照此條件進行驗證試驗，得到乳鐵蛋白得率為84.43%，理論值的相對誤差為0.55%，說明該方法具有一定的實際可操作性。

3 討論

乳鐵蛋白作為一種新興功能性食品配料，具有很高的營養價值。

圖6 各兩因素交互作用的響應面

近年來，乳鐵蛋白的分離純化工藝不斷提高，已成功應用于酸奶、嬰幼兒配方奶粉等產品中[23]。楊安樹[24]等采用 CM-Sepharose fast flow 陽離子交換柱對經脫脂、酪蛋白沉淀及超濾后的預處理樣品進行進一步分離，得到純度為95%的乳鐵蛋白。任璐等[25]對流動相不同pH 值對分離效果的影響作了分析并得出相似結論，pH 值在7.0～7.3 之間的流動相較為適宜，能夠較好地分離LF 與其他雜蛋白。可見通過此方法能很好地分離牛初乳中的乳鐵蛋白，為乳鐵蛋白的純化奠定了基礎。