大蒜素及納豆菌對(duì)福建白兔生產(chǎn)性能、抗氧化活性、腸道形態(tài)及菌群的影響

陳冬金，王錦祥，孫世坤，陳敏卿，桑 雷，陳巖鋒，高承芳，謝喜平 *

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2. 龍巖市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 龍巖 364000）

0 引言

【研究意義】近年來(lái)，兔肉作為“三高三低”的保健肉，越來(lái)越受到人們的青睞，其消費(fèi)市場(chǎng)逐漸拓展，市場(chǎng)潛力大。福建白兔屬小型肉用地方兔，2014年通過(guò)了國(guó)家畜禽遺傳資源專家委員會(huì)認(rèn)定[1]，2015年列入福建省畜禽遺傳資源保護(hù)名錄和中國(guó)畜禽遺傳資源志，其全身披白色毛，具有適應(yīng)性廣、繁殖性能好、肉質(zhì)優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)[2]，是中國(guó)地方優(yōu)良兔品種。與大種肉兔相比，其肌肉營(yíng)養(yǎng)成分高（肌肉粗蛋白含量高），肉質(zhì)鮮嫩（肌纖維面積小，肌內(nèi)脂肪含量高）[3?4]。福建白兔耐粗飼、易飼養(yǎng)、價(jià)格高，近年來(lái)該品種受到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和福建省農(nóng)業(yè)部門的重視，福建白兔的養(yǎng)殖戶和養(yǎng)殖企業(yè)逐漸增多，養(yǎng)殖量不斷增多，但其飼養(yǎng)方式主要是采取限制飼養(yǎng)。自由采食，幼兔消化道疾病發(fā)生率和死亡率高，適宜的家兔飼料添加劑可以讓家兔自由采食的同時(shí)保證較高的成活率。【前人研究進(jìn)展】大蒜素（Allicin）是以大蒜鱗莖為原料提取的產(chǎn)品，也可化工合成。動(dòng)物飼料中使用的大蒜素一般是由合成的大蒜油為原料制成的預(yù)混料，具有清除自由基和抗氧化[5]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[6]等功能，可改善飼料的適口性、提高采食量、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、提高生產(chǎn)性能[7]、減少動(dòng)物患病率[8]，倍受養(yǎng)殖行業(yè)的青睞。納豆芽孢桿菌（Bacillus natto，BN），屬枯草芽孢桿菌納豆菌亞種，革蘭陽(yáng)性菌，只具有單層細(xì)胞外膜，是一類好氧型、內(nèi)生抗逆孢子的桿狀細(xì)菌，具有廣譜抗菌活性[9]和極強(qiáng)的抗逆能力[10]；可以調(diào)節(jié)腸道菌群，增強(qiáng)動(dòng)物細(xì)胞免疫反應(yīng)[11]，并能生成多種蛋白酶、糖化酶、脂肪酶等，降解植物性飼料中的碳水化合物，提高飼料的轉(zhuǎn)化率。陳兵等[12]研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加200 mg·kg?1的納豆芽孢桿菌可以提高肉雞的平均日增重、日采食量。在推行無(wú)抗飼養(yǎng)的大環(huán)境下，納豆菌作為益生菌既能提高動(dòng)物免疫力，又不會(huì)出現(xiàn)耐藥性等不利影響，是環(huán)境友好型飼料添加劑。納豆菌在豬[13]、羊[14]、牛[15]上作為飼料添加劑使用的案例均有研究報(bào)道。大蒜素能抑制有害菌，且對(duì)益生菌如干酪乳桿菌有促進(jìn)作用，這是大蒜既能防病治病，又能夠促進(jìn)食欲、幫助消化的重要原因[16]。丁酸梭菌與大蒜素同用，對(duì)青腳麻雞具有顯著的生長(zhǎng)促進(jìn)作用[17]。【本研究切入點(diǎn)】大蒜素和納豆菌作為動(dòng)物飼料添加劑，兩者均可提高采食量、降低發(fā)病率、促進(jìn)生長(zhǎng)和改善飼養(yǎng)環(huán)境，目前關(guān)于二者聯(lián)合使用在肉兔中的飼養(yǎng)效果未見(jiàn)報(bào)道。大蒜素既可提高食欲，又可抑制有害菌、促進(jìn)有益菌（如納豆菌）的生長(zhǎng)，兩者聯(lián)合使用，可能有協(xié)同作用。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)通過(guò)研究大蒜素、納豆菌及其復(fù)合物對(duì)福建白兔生長(zhǎng)性能、抗氧化活性、腸道形態(tài)和菌群的影響，旨在為肉兔生產(chǎn)中合理開(kāi)發(fā)利用無(wú)抗飼料添加劑，且為開(kāi)發(fā)適用于肉兔自由采食飼喂方式的飼料提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物為健康的福建白兔（40 日齡，公母各半），35 日齡時(shí)購(gòu)自武平縣武東鄉(xiāng)袁田村福建白兔生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)，暫養(yǎng)5 d 后開(kāi)始試驗(yàn)。大蒜素購(gòu)自濰坊加易加生物科技有限公司，大蒜素含量25%；納豆芽孢桿菌凍干粉購(gòu)自福建盛德實(shí)業(yè)有限公司，含量為3.5×108CFU·g?1。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所兔場(chǎng)基地進(jìn)行。選擇平均體重為（657.25±102.21）g 的健康福建白兔48 只，隨機(jī)分為4 個(gè)處理組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧（A 組，CK），試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧上分別添加200 mg·kg?1大蒜素、0.5%納豆菌、200 mg·kg?1大蒜素+0.5%納豆菌，設(shè)置大蒜素處理組（B 組）、納豆菌處理組（C 組）和大蒜素+納豆菌處理組（D組）。每組12 只，飼養(yǎng)于仔兔代謝籠（規(guī)格60 cm×40 cm×40 cm），每籠1 只。試驗(yàn)期為50 d。全價(jià)顆粒料飼喂，每天早晚飼喂2 次，乳頭式飲水器自由飲水。飼養(yǎng)管理與免疫程序按常規(guī)進(jìn)行。全價(jià)飼糧參照NRC（1977） [18]家兔營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和De Blas 等[19]的生長(zhǎng)兔營(yíng)養(yǎng)需求進(jìn)行配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of basic diets (DM basis)

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定 試驗(yàn)于40 日齡正式開(kāi)始，于90 日齡結(jié)束，試驗(yàn)始末對(duì)試驗(yàn)兔空腹稱重，試驗(yàn)期每日記錄每只兔采食情況，包括每日喂料量、剩余料量及浪費(fèi)料量，并觀察試驗(yàn)期間的腹瀉和死亡情況。計(jì)算仔兔的平均日增重（Average daily gain，ADG）、平均日采食量（Average daily feed intake，ADFI）及料重比（Feed/gain，F(xiàn)/G），計(jì)算公式為料重比=消耗飼料總量（kg）/增重總量（kg）。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采集每只兔血樣后屠宰，進(jìn)行屠宰測(cè)定，測(cè)定全凈膛重、半凈膛重等。無(wú)菌采集盲腸內(nèi)容物進(jìn)行菌群測(cè)定，采集腸道組織樣品用于形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.2 血清抗氧化酶的測(cè)定 丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathion peroxidase，GSH-Px）活性和總抗氧化能力（Total antioxidant capacity, T-AOC），均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定。

1.3.3 腸絨毛高度和隱窩深度 家兔屠宰后迅速剖開(kāi)腹腔，每只家兔十二指腸、空腸和回腸的相同部位各取下一段腸管1 cm（回腸取最上端），生理鹽水沖洗干凈，放入10%中性甲醛中固定。石蠟包埋，連續(xù)橫斷切片，厚6 μm，進(jìn)行常規(guī)HE 染色。光鏡下詳細(xì)觀察和比較各組腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化情況。每張切片挑選3 個(gè)100 倍視野進(jìn)行拍照。拍照時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件，每張切片選取5 根完整的絨毛，分別測(cè)量絨毛高度（mm）、隱窩深度（mm）；計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)絨毛和隱窩的數(shù)量，計(jì)算視野面積（mm2），求出單位面積內(nèi)絨毛和隱窩的數(shù)量。

1.3.4 盲腸微生物多樣性 取各組家兔盲腸食糜，迅速放置液氮中，備用。

（1） DNA 抽提和 PCR 擴(kuò)增。根據(jù) E.Z.N.A.?soil DNA kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）說(shuō)明書進(jìn)行微生物群落總 DNA 抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000 測(cè)定DNA 濃度和純度；使用338F（5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)16S rRNA 基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃ 預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s），然后 72 ℃ 穩(wěn)定延伸 10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存（PCR 儀：ABI GeneAmp? 9700 型）。PCR 反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol·L?1dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol·L?1）0.8 μL，下游引物（5 μmol·L?1）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)。

（2）Illumina Miseq 測(cè)序。將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen biosciences，union city，CA，USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 并用Quantus? Fluorometer（Promega，USA）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit 進(jìn)行建庫(kù)：接頭鏈接；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；磁珠回收PCR 產(chǎn)物得到最終的文庫(kù)。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）[20]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010 和SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）檢驗(yàn)組間差異顯著性，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑對(duì)福建白兔生產(chǎn)性能的影響

2.1.1 對(duì)腹瀉率和死亡率的影響 由表2 可知，試驗(yàn)全期，對(duì)照A 組的腹瀉率明顯高于試驗(yàn)組， B 組與C 組腹瀉率相當(dāng)， D 組的腹瀉率最低；且40～60 日齡A 組的試驗(yàn)兔腹瀉率和死亡率最高， D 組死亡率和腹瀉率最低。

表2 不同添加劑對(duì)福建白兔腹瀉率和死亡率的影響Table 2 Effects of supplements on rates of diarrhea incident and mortality of Fujian white rabbits

2.1.2 對(duì)生長(zhǎng)性能的影響 由表3 可知，各組的初始體重差異不顯著，試驗(yàn)結(jié)束的終末體重，處理D 組顯著高于處理A 組（P＜0.05），極顯著高于處理B 組（P＜0.01）；平均日采食量處理C 和D 組都極顯著高于處理B 組（P＜0.01）；平均日增重處理D 組均極顯著高于處理A 組、處理B 組（P＜0.01），顯著高于處理C 組（P＜0.05）；與其他組比較，料重比D 組最低，但各組差異不顯著。

表3 不同添加劑對(duì)福建白兔生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effect of supplements on growth performance of Fujian white rabbits

2.1.3 對(duì)福建白兔屠宰性能的影響 由表4 可知，全凈膛重，處理D 組均顯著高于處理A 組（P＜0.05）和處理B 組（P＜0.01）；半凈膛重處理D 組極顯著高于處理A 和處理B 組（P＜0.01），處理C 組顯著高于處理B 組（P＜0.05）。全凈膛率和半凈膛率各組之間差異不顯著。

表4 不同添加劑對(duì)福建白兔屠宰性能的影響Table 4 Effect of supplements on slaughter performance of Fujian white rabbits

2.2 對(duì)福建白兔血清抗氧化酶的影響

由表5 可知，血清中GSH-Px 含量，處理B、C、D 三組都顯著高于處理A 組，且 B 組和A 組之間差異顯著（P＜0.05），C、D 組和A 組之間差異均為極顯著（P＜0.01）。

表5 不同添加劑對(duì)福建白兔血清抗氧化酶的影響Table 5 Effect of supplements on serum antioxidant enzymes of Fujian white rabbits

2.3 對(duì)福建白兔腸道形態(tài)的影響

由表6～7 可知，不同組別的腸道絨毛長(zhǎng)度和數(shù)量差異不顯著；回腸隱窩深度處理B 組顯著高于處理C 組（P＜0.05）；空腸隱窩深度，處理B、C、D 組高于處理A 組，且B 組與A 組差異極顯著（P＜0.01），D 組與A 組差異顯著（P＜0.05），B 組顯著高于C 組（P＜0.05）。十二指腸隱窩深度不同組別之間差異不顯著。回腸隱窩數(shù)量A 組顯著高于組C 和D 組（P＜0.05），其他差異不顯著。不同組織切片見(jiàn)圖1。

圖1 福建白兔腸道組織切片形態(tài)（100×）Fig. 1 Morphology of sectioned intestinal tissues of Fujian white rabbits (100×)

表6 不同添加劑對(duì)福建白兔腸道絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度的影響Table 6 Effects of supplements on intestinal villus length and crypt depth of Fujian white rabbits（單位：mm）

2.4 對(duì)福建白兔盲腸微生物區(qū)系的影響

2.4.1 不同添加劑對(duì)福建白兔盲腸菌群 Alpha 多樣性分析 腸道微生物測(cè)序，對(duì)不同組別腸道內(nèi)容物進(jìn)行測(cè)序，共獲得有效序列數(shù)為1 702 885 條，每條序列平均長(zhǎng)度為408.64 bp，以97%的序列一致性。由表8 可知，處理A 組的群落多樣性Shannon 指數(shù)顯著高于C 組（P<0.05），其他差異不顯著。

表8 試驗(yàn)各組測(cè)序結(jié)果及Alpha 多樣性分析Table 8 Sequence and alpha diversity of treatment groups

2.4.2 不同組別福建白兔盲腸菌群結(jié)構(gòu)分析 （1）不同組別福建白兔盲腸菌群門水平的結(jié)構(gòu)分析。不同組別福建白兔盲腸菌群由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門 （Bacteroidetes）、 細(xì)菌未分類門（Unclassified_k__norank_d__Bacteria）、 放線菌門（Actinobacteria）；軟壁菌門（Tenericutes）；變形菌門（Proteobacteria）；髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria）等組成，其中前 3 種菌門是不同組別中菌群的主要組成部分，分別占73.02%、12.03%、2.06%以上（圖2）。

圖2 不同處理組門水平腸道微生物豐度Fig. 2 Intestinal microbial abundance at phylum level of treatment groups

表7 不同添加劑對(duì)福建白兔腸道絨毛數(shù)量和隱窩數(shù)量的影響Table 7 Effects of supplements on intestinal villi population and crypts of Fujian white rabbits（單位：根·mm?2）

（2）不同組別福建白兔盲腸菌群科水平的結(jié)構(gòu)分析。不同組別福建白兔盲腸菌群在科水平以瘤胃菌科Ruminococcaceae、優(yōu)桿菌科Eubacteriaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、克里斯滕森菌科 Christensenellaceae 等為主，分別占27.28%、13.15%、10.53%、6.86%以上（圖3）。腸道菌梭菌目-0-未分類（Unclassified_o_ Clostridiales）在組間差異顯著（P<0.05），A 組顯著高于D 組，其他差異不顯著（圖4）。

圖3 不同處理組腸道微生物科水平豐度Fig. 3 Intestinal microbial abundance at family level of treatment groups

圖4 不同處理組腸道微生物科水平菌群差異性Fig. 4 Differential intestinal microflora at family level of treatment groups

（3）不同組別福建白兔盲腸菌群屬水平的結(jié)構(gòu)分析。不同組別福建白兔盲腸菌群在屬水平以優(yōu)桿菌科的norank_f（norank_f__Eubacteriaceae）、瘤胃球菌科的NK4A214 菌屬（Ruminococcaceae_NK4A214_group）、克里斯滕森菌科的R-7 菌屬（Christensenellaceae_R-7_group）、絨毛桿菌科的norank_f__菌屬（norank_f__Muribaculaceae）和梭菌目vadinBB60 菌科的norank_f__菌屬（norank_f__Clostridiales_vadin-BB60_group）為主，分別占9.86%、10.05%、6.83%、7.10%、6.69%以上（圖5）。Ruminococcaceae_UCG-010 在組間差異顯著 (P＜0.05) ，A 組顯著高于C 組；unclassified_o__Clostridiales 在組間差異顯著 (P＜0.05) ，A 組顯著高于D 組（圖6）。

圖5 不同處理組腸道微生物屬水平豐度Fig. 5 Intestinal microbial abundance at genus level of treatment groups

圖6 不同處理組腸道微生物菌群屬水平差異性Fig. 6 Differential intestinal microflora of treatment groups

3 討論

兔是單胃草食動(dòng)物，斷奶仔兔自由采食，容易發(fā)生消化道紊亂，造成腹瀉甚至死亡[21]。本試驗(yàn)各組的腹瀉率和死亡率較高，這是由于采用自由采食的飼喂方式。處理B 組與對(duì)照A 組相比，腹瀉率和死亡率明顯降低，這與Marchese 等[8]研究表明大蒜素可以減少發(fā)病率以及降低死亡率的結(jié)果一致。何曉政等[17]研究顯示大蒜素和丁酸梭菌聯(lián)用可以促進(jìn)青腳麻雞的生長(zhǎng)。大蒜素可提高免疫力[6]，納豆芽孢桿菌具有調(diào)節(jié)腸道和提高機(jī)體免疫力[11]的功效。本試驗(yàn)全期，對(duì)照組的腹瀉率明顯高于試驗(yàn)組，大蒜素或納豆菌處理組腹瀉情況相當(dāng)，大蒜素和納豆菌復(fù)合處理組（D 組）的腹瀉率最低；且40～60 日齡階段對(duì)照A 組腹瀉和死亡數(shù)最高，D 組最低，說(shuō)明大蒜素和納豆芽孢桿菌有降低死亡和腹瀉的作用，而且兩者一起使用效果更佳，其原因可能是處理D 組腸道有害菌unclassified_ o_ Clostridial 顯著低于對(duì)照A 組，這也驗(yàn)證了處理D 組試驗(yàn)兔的平均日增重和料重比均高于其他組別。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）是體內(nèi)重要的自由基捕獲酶之一，不僅具有清除自由基和衍生物的作用，還可減少脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化損傷的能力[22]。腸絨毛長(zhǎng)短直接影響著動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，絨毛長(zhǎng)度增加可以增大小腸吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的面積。腸隱窩是絨毛根部上皮陷入固有層形成的管狀腺，隱窩深度反映上皮細(xì)胞的生產(chǎn)率，上皮細(xì)胞從隱窩基部向絨毛端遷移、分化，形成具有吸收功能的絨毛細(xì)胞[23]。腸道微生物對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝、生長(zhǎng)、免疫等起著不可忽視的重要作用。而腸道微生物的變化又受到宿主的品種、日糧、所處環(huán)境，特別是胃腸道環(huán)境的影響，因此宿主與其腸道菌群之間建立了一種共生關(guān)系[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處理組血清中的GSH-Px 含量顯著高于對(duì)照A 組，這與大蒜素具有清除自由基和抗氧化[5]的功效有關(guān)。空腸隱窩深度對(duì)照A 組低于處理組，這可能是由大蒜素可促進(jìn)食欲且納豆菌有促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)的作用所致。

16S rRNA 的高通量測(cè)序，多樣性分析得出對(duì)照組與試驗(yàn)組腸道菌群菌落豐富度無(wú)明顯差異。菌群結(jié)構(gòu)分析，以厚壁菌門、擬桿菌門為主，兩者占85.05%以上，門水平差異不顯著；不同組別福建白兔盲腸菌群在科水平以瘤胃菌科、優(yōu)桿菌科、毛螺菌科、克里斯滕森菌科等為主，分別占27.28%、13.15%、10.53%、6.86%以上；不同組別福建白兔盲腸菌群在屬水平以優(yōu)桿菌科的norank_f 屬、瘤胃球菌科的NK4A214 菌屬、克里斯滕森菌科的R-7 菌屬、絨毛桿菌科的norank_f 菌屬為主，分別占9.86%、10.05%、6.83%、7.10%以上，對(duì)照組Ruminococcaceae_UCG-010 顯著高于納豆菌處理（P<0.05）。有報(bào)道顯示菌屬Ruminococcaceae_UCG-010 可能影響血糖的升高[25]；He 等[26]的研究表明番茄籽油可以降低小鼠腸道unclassified_o__Clostridiales 菌屬，進(jìn)而改善小鼠的高血脂癥。對(duì)照組unclassified_o__Clostridiales 相對(duì)豐度顯著高于大蒜素和納豆菌復(fù)合處理組（P＜0.05），說(shuō)明大蒜素和納豆菌聯(lián)合使用可調(diào)節(jié)腸道菌群，改善血脂。