腫瘤-睪丸抗原聯蛋白α2在肝細胞癌中的表達及臨床意義的多組學研究

張 娟， 陳茂培， 董良慶， 林友培， 潘教孟， 宋國賀， 阿曄嶺， 張 舒， 高 強， 任正剛

復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所，復旦大學癌變與侵襲原理教育部重點實驗室，上海 200030

近年來，美國癌癥研究所臨床蛋白質組腫瘤分析計劃(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium, CPTAC)、癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)、國際癌癥基因組聯盟(International Cancer Genome Consortium，ICGC)等大規模腫瘤研究計劃的開展，及基因組、轉錄組、蛋白質組、免疫蛋白組學和生物信息學等組學技術的發展，快速地推動了腫瘤免疫的相關研究。腫瘤-睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)是一類限制性表達在生殖細胞，而在其他正常人體組織中不表達或低表達，在多種腫瘤中異常表達的腫瘤相關抗原。生殖細胞不表達主要組織相容性復合體Ⅰ(major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ)，且天然存在的血睪屏障共同導致CTA基因產物不能與正常人的免疫系統接觸，較少引起自身免疫反應，故CTA可作為腫瘤免疫治療的理想靶點。1991年，研究人員[1]利用T細胞表位克隆技術在黑素瘤中發現第一個CTA：黑素瘤抗原A1(melanoma antigen-A1,MAGE-A1)。目前，已有276個CTA基因被發現，但幾乎所有關于CTA的研究都僅限于mRNA表達水平。本研究首次從多組學鑒定肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中免疫治療的新靶點聯蛋白α2(catenin alpha 2，CTNNA2), 并探討其作為HCC免疫治療靶標的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年至2015年復旦大學附屬中山醫院收治159例手術切除的HCC患者的新鮮標本，所有病例均經病理診斷證實。其中，男性128例，女性31例，年齡20～81歲，平均年齡為54歲。每例患者的手術標本在肝癌術后分別取癌組織和癌旁組織，并立即經液氮速凍后置液氮中保存，以備轉錄組測序技術(RNA sequencing，RNA-Seq)、串聯質譜標簽(tandem mass tag，TMT)定量蛋白組學、磷酸化組學富集及免疫蛋白組學和反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測。

1.2 細胞培養 肝癌細胞株MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、PLC/PRF/5、Hep3B和正常細胞株(L02)來自復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所。肝癌細胞株JHH6、SNU449、SNU354、SNU182由上海生命科學研究院高大明課題組惠贈。細胞培養采用Gibco DMEM培養基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素)于含5% CO2的37℃恒溫培養箱培養。

1.3 總RNA提取 將手術后切取的肝癌組織和癌旁組織迅速放入液氮中，用TRIzol (Invitrogen，15596026)提取組織和細胞中的總RNA，采用紫外分光光度計測定A260/A280值。取2 μg 總 RNA進行反轉錄。cDNA 反應條件和反應體系參考試劑盒(TaKaRa)說明書。

1.4 RNA-seq定量基因組學 新鮮冷凍組織研磨后加入TRIzol中并純化總RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer上檢測RNA的完整性(RNA完整性數>5)。采用Sera-Mag oligo (dT)珠(Thermo Scientific)分離RNA和fragmentation reagents kit(NEB)快速片段化,并根據TruSeq RNA (Illumina)說明書，進行cDNA合成、末端修復、A尾添加和連接。最后在Agilent 2100生物分析儀上測量產品的大小和濃度。在Illumina Hi Seq X Ten(2 X 150-核苷酸讀取長度)進行測序，序列覆蓋4 000萬個配對讀長(reads)。對于每個HCC及癌旁樣本，RNA-seq平均分別為40.1 M和39.1 M高質量讀長。RNA-seq數據分析鑒定了19 860個蛋白質編碼基因，平均每個樣本有18 839個基因，涵蓋了蛋白質組學鑒定中的絕大多數基因[2]。

1.5 TMT標記及高效液相色譜法(HPLC)分級 將肝癌組織和癌旁組織在液氮中研磨成粉末后進行裂解，采用過濾輔助樣品制備(FASP)工藝進行蛋白質消化，多肽通過離心洗脫，用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒進行蛋白濃度測定。采用真空離心干燥法對進一步的產物進行胰酶酶解成肽段。50對肝癌和癌旁樣本混合樣本作為TMT標記中使用的“內參”。 用FASP法制備混合樣品中的肽，并對其進行了分離，每個離心管每套TMT標記實驗加入400 mg作為內參。根據TMT試劑盒標記肽段：每組11個通道，每個通道用400 mg肽標記，混合肽被標記為126通道并作為內參，其他10個通道分別標記5對肝癌和癌旁樣本。肽段采用高pH反向HPLC分級(色譜柱為Waters XBridge BEH300 C18 column)。質譜分析肽段采用HPLC Easy-nLC1000超高效液相系統分離，并同步使用Thermo Scientific QExactive Plus進行檢測和分析。肽段分離后進行電離，然后進入Q ExactiveTM Plus質譜進行分析。肽段母離子及其二級碎片均采用Orbitrap(Thermo Fisher Scientific)檢測和分析。二級質譜數據采用MaxQuant search engine(v.1.6.1.0)和Swissprot數據庫檢索，同時進行質譜質控[2]。

1.6 磷酸化肽段富集及分析 磷肽富集是根據High-Select Fe-NTA 試劑盒(Thermo Science，A32992)說明書，用200 mL負載緩沖液[(80% 乙腈(ACN)，0.1%三氟乙酸(TFA)]溶解24個組的蛋白。將試劑盒中旋柱的樹脂分成24個等份，并與每個肽組分混合，肽-樹脂混合物在室溫下孵育15 min，然后轉移到過濾器尖端(Axygen,TF-20-L-R-S)。離心后取出上清液，然后用200 μL洗滌緩沖液(80% ACN，0.1% TFA)和200 μL H2O對吸附磷肽的樹脂進行洗滌，去除非特異性吸附肽。用100 μL洗脫緩沖液(50% ACN,5% NH3，H2O)將磷酸肽從樹脂中洗脫。收集洗脫液進行冰凍干燥進行質譜分析。磷酸化肽段采用Orbitrap(Thermo Fisher Scientific)檢測和分析[2]。

1.7 免疫多肽組學鑒定MHC-1抗體結合的抗原多肽 依據Pierce 交聯免疫共沉淀試劑盒(Thermo Scientific，26147)說明書，首先將肝癌組織和癌旁正常肝組織裂解后測蛋白濃度，每個樣品取10 mg蛋白裂解液，對泛人類白細胞抗原Ⅰ(HLA-Ⅰ)分子進行免疫親和純化，4℃下將MHC-Ⅰ抗體 (Thermo Scientific，MA1-70111)與Pierce 蛋白 A/G瓊脂糖交聯柱中結合共價結合3 h，然后在交聯柱中加入洗脫緩沖液洗脫HLA-Ⅰ蛋白。免疫沉淀后，用10%乙酸從純化的MHC分子中洗脫多肽。用10 000相對分子質量過濾器進一步純化洗脫肽，然后用真空離心法進行濃縮，在C18-based STAGE尖端上凍干脫鹽。最后進行液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)分析，方法同以上蛋白組學。基于標準的Uniport數據庫和具有IEDB數據庫鑒定屬于CTNNA2基因編碼的抗原肽。本研究使用腫瘤睪丸數據庫(CT database，http://www.cta.lncc.br/)的基因列表鑒定所有的CTA[3]。

1.8 RT-PCR檢測CTNNA2 mRNA表達 采用RT-PCR法檢測CTNNA2的表達。所用引物及擴增片段如下。CTNNA2上游引物: 5′-GGA CGC TAA CAG TGG AAA GG-3′；下游引物:5′-GAG TGG CTT GCT CTA CAG AGG-3′。內參GAPDH上游引物: 5′- GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′；下游引物:5′- GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′。PCR 反應條件：60℃退火30 s，擴增40個循環。

1.9 統計學處理 應用 SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用卡方檢驗(n≥5)或連續校正卡方檢驗(1≤n<5)，檢驗水準(α)為0.05。

1.10 蛋白相互作用調控網絡構建 用STRING在線軟件(http://www.string.db.org/)進行CTNNA2蛋白的相互作用網絡分析。

2 結 果

2.1 蛋白基因組學提示CTNNA2在HCC高表達 目前，在腫瘤睪丸抗原數據庫(CT Database，http://www.cta.lncc.br/)已有276個CTA被發現。本課題組前期對我院159例HCC組織和癌旁組織采用RNA-Seq定量轉錄組學和TMT定量蛋白組學方法等多組學策略，解析了HCC發生發展的分子機制，進一步發現有17種差異表達的CTA(圖1A)。目前關于CTNNA2的研究甚少，且在肝癌中尚未報道。本研究結合TCGA RNA-seq(圖2A)及Human Protein Atlas(HPA)數據庫(圖2B)發現，CTNNA2在HCC、神經膠質瘤、子宮內膜癌、結直腸癌、腎癌等腫瘤中表達水平相比其他腫瘤較高，提示其可能在腫瘤中表達。但是，CTNNA2在HCC中生物功能和臨床意義仍不清楚，因此，本研究進一步分析其在HCC中的表達情況及臨床意義。

圖1 肝癌中CTNNA2在轉錄組學和蛋白組學中的差異分析A：肝癌中17個CTA在轉錄組學和蛋白組學中的差異分析；B：CTNNA2在轉錄組學和蛋白組學的表達陽性率， RNA-seq測序結果顯示CTNNA2表達陽性率為80.5%(128/159)，TMT定量蛋白組學顯示 CTNNA2表達陽性率為54.7%(87/159)；C：CTNNA2在轉錄組學和蛋白組學表達的相關性分析。

圖2 在多種腫瘤里面的CTNNA2的mRNA和蛋白水平的表達情況A：CTNNA2在多種腫瘤的mRNA表達水平；B：CTNNA2在多種腫瘤的蛋白表達水平。

RNA-Seq結果(圖1B)顯示，在HCC癌組織中CTNNA2表達陽性率為80.5%(128/159)， TMT定量蛋白組學顯示，CTNNA2表達陽性率為54.7%(87/159)，其中二者表達相關性的r為0.668(P<0.001，圖1C)。二者的不一致說明了CTNNA2-RNA轉錄后的產物可能經轉錄后(如甲基化、剪接、加尾等)和翻譯后加工修飾(蛋白降解和輸出)的精細調控機制。RNA-Seq定量基因組學數據分析(圖3A)提示，肝癌中CTNNA2在mRNA水平比癌旁組織表達水平較癌旁高11.24倍(P<0.001)。

同時，本研究收集了33對HCC癌組織和癌旁組織，CTNNA2在癌組織表達陽性率為54.5%，肝癌中CTNNA2在mRNA水平比癌旁組織升高15.23倍(P=0.049；圖3B)。RT-PCR結果顯示，CTNNA2在HCCLM3、Huh7、SNU449、SNU354、SNU182、PLC/PRF/5、Hep3B 肝癌細胞系中表達較正常肝癌細胞系L02表達水平明顯升高(圖3C)。TMT定量蛋白組學數據分析(圖3D)提示，肝癌中CTNNA2在蛋白水平較癌旁表達高2.66倍(P<0.001)，HPA數據庫的免疫組化結果亦提示，CTNNA2在睪丸組織中高表達，在HCC組織中中等或高表達，而在正常肝中低表達(圖4)。

圖3 CTNNA2在HCC組織和肝癌細胞系中的表達A：RNA-seq定量轉錄組學數據提示CTNNA2在癌組織中較癌旁表達水平高；B：在33配對癌組織和癌旁組織中采用RT-PCR證實CTNNA2在癌組織中較癌旁表達水平高；C：CTNNA2在12種肝癌細胞系中的表達；D：TMT定量蛋白組學數據提示CTNNA2在癌組織中較癌旁表達水平高. *P<0.05，**P<0.01,***P<0.001與癌旁組比較。

圖4 免疫組化結果顯示CTNNA2在睪丸、正常肝和HCC中的表達Original magnification:×400

2.2 蛋白組學分析CTNNA2表達與HCC臨床病理學特征的關系 CTNNA2蛋白表達水平與甲胎蛋白(P=0.019)、門靜脈癌栓(P=0.028)顯著相關。CTNNA2蛋白表達水平與HCC患者的年齡、性別、腫瘤大小和數量、TNM分期、BCLC分期等因素無明顯相關性(表1)。

表1 CTNNA2蛋白表達與HCC臨床病理學特征的關系 N=159

2.3 CTNNA2蛋白結構、相互作用蛋白和啟動子的甲基化水平 CTNNA2蛋白是一種機械感應蛋白，包含2個長春花素同源結構域，在細胞骨架張力的作用下發生構象變化，從而改變鈣黏蛋白與肌動蛋白細胞骨架之間的聯系(圖5)，它與β連環蛋白(β-catenin)、γ-catenin、跨膜蛋白、E-鈣黏蛋白(E-cadherin，ECAD)和p120共同構成黏附連接(AJ)復合物。

圖5 聯蛋白α2蛋白結構域

腫瘤細胞中CTNNA2基因發生突變后，其蛋白結構域發生改變不能與β-catenin連接成細胞黏附蛋白細胞骨架，導致細胞質中的β-catenin蛋白Ser552殘基磷酸化后入核，增加其靶基因轉錄，進一步導致腫瘤侵襲和轉移。

磷酸化組學結果(圖6A)提示，HCC中CTNNB1的磷酸化水平較癌旁偏低(P<0.001)。進一步分析CTNNA2高表達的HCC患者中β-catenin蛋白Ser552殘基的磷酸化水平，差異無統計學意義 (P=0.59，圖6B)。據此本研究推測，在HCC中高表達的CTNNA2影響β-catenin蛋白Ser552殘基的磷酸化可能不是其調控HCC的主要機制。同時本研究還首次檢測到CTNNA2蛋白(Ser262、Ser321、Ser640、Ser651、Ser654、Ser667、Tyr653和Tyr657)多個磷酸化位點也發生變化(圖6C)。

口咽鱗癌和砷暴露的尿路上皮癌中CTNNA2基因甲基化水平升高。然而本研究通過分析The Cancer Genome Atlas(TCGA)中HCC相關數據發現，HCC癌旁組織中CTNNA2啟動子為正常甲基化表現，而癌組織中呈現去甲基化表現(P<0.001，圖6D)。

圖6 HCC中CTNNB1和CTNNA2蛋白的磷酸化水平及CTNNA2啟動子的甲基化水平A：在HCC癌組織中β-catenin蛋白Ser552殘基的磷酸水平較癌旁組織低；B：在CTNNA2高表達的癌組織中β-catenin蛋白Ser552殘基的磷酸水平較癌旁差異無統計學意義；C：在HCC中CTNNA1編碼的蛋白aN-catenin自身的磷酸化水平；D：在肝癌中CTNNA2的DNA啟動子區呈低甲基化水平)。

STRING蛋白相互作用調控網絡分析提示，與CTNNA2可能存在相互作用的蛋白有β-catenin(CTNNB1)、αE連環蛋白(CTNNA1，αE-catenin)、鈣黏蛋白2(CDH2，cadherin-2)、鈣黏蛋白4(CDH4，cadherin-4)、精子相關抗原9(SPAG9)、癌基因調節的細胞黏附蛋白(CDON)、細胞分裂周期蛋白42(CDC42)等(圖7)。以上結果均提示，參與調控肝癌中CTNNA2基因和蛋白的功能可能與自身磷酸化、啟動子區DNA甲基化及與其他多種蛋白相互作用相關，但其具體的生物學功能及其信號通路有待進一步實驗證實。

圖7 CTNNA2蛋白的相互作用網絡分析

2.4 CTNNA2的免疫原性 MHC-Ⅰ參與CD8+T細胞的限制性識別，MHC-Ⅰ類分子將內源性衍生的多肽抗原呈遞給CD8+T細胞，進一步誘導其特異性細胞毒性反應。本研究對29例HCC患者的腫瘤和13例癌旁組織進行免疫蛋白組學分析，結果(圖8A)顯示，與MHC-Ⅰ結合的抗原多肽共有30種，均為8個氨基酸大小，其中KAHVLAAS表達率最高，但其表達豐度偏低(圖8B)。另外，IFHQEKSK、LANRFKEF、MRLLSHLK、PLLVLIEA、PVQALSEF、TKKTRDLR、TSLIQAAK、VKLVRMAA、VPLLVLIE和VRAARALL這10種抗原多肽只在HCC的癌組織標本中檢測到，其中IFHQEKSK表達豐度最高。

圖8 免疫多肽組學鑒定HCC癌組織中的CTNNA2抗原多肽A：MHC-Ⅰ免疫共沉淀的CTNNA2抗原多肽分析實驗流程；B：CTNNA2豐度較高的抗原多肽質譜。

3 討 論

原發性肝癌是我國第2位腫瘤致死病因及第4位常見惡性腫瘤，其中 85%～90%的原發性肝癌為HCC。目前，靶向治療、免疫治療或二者聯合治療在肝癌患者的有效應答率仍不太樂觀。因此，新的免疫治療靶點亟待發掘。免疫治療中的CTA如MAGEA1、紐約食管鱗狀上皮癌抗原1(NY-ESO-1)等已作為腫瘤疫苗進入HCC的臨床試驗中[4]。HCC是異質性最高的腫瘤之一，隨著多組學技術的不斷進步和發展，精準的肝癌免疫分子分型利于肝癌個體化診斷與個性化疫苗的免疫治療[5]。

α-聯蛋白屬于跨膜細胞黏附分子家族。人α-聯蛋白有3種亞型，分別由CTNNA1(αE-catenin)、CTNNA2(αN-catenin)和CTNNA3(αT-catenin)基因所編碼。CTNNA2基因的定位于2號染色體p12上，基因DNA片段的長度為815 401 bp，含29個外顯子，包含7個不同的mRNA轉錄本。αN-catenin主要表達于神經組織，控制突觸接觸的穩定性，調節突觸、小腦和海馬的層壓的形態可塑性[6]。其中，αE-和αT-catenin由αN-catenin演化而來。αN-catenin是由860個氨基酸組成的蛋白質，相對分子質量為102 000。αN-catenin作為鈣黏蛋白黏附受體與細胞骨架之間的連接子(圖5)，控制細胞與細胞的黏附和分化[7]。CTNNA2通過多種形式調控腫瘤的發生發展。從克隆進化角度來看，CTNNA2為9種腫瘤的亞克隆擴增的驅動因素[8]。全基因組測序和全基因組關聯試驗研究(GWAS)提示，乳腺癌和胰腺導管腺癌存在CTNNA2的缺失及內含子的突變[9-10]。

表觀遺傳學甲基化和乙酰化參與調控CTA的基因表達。口咽鱗癌和砷暴露相關的尿路上皮癌CTNNA2啟動子甲基化水平升高。作為黏附分子家族的一員，CTNNA2與腫瘤的侵襲轉移相關，microRNA-4885可以結合在CTNNA2的3′非翻譯區(untranslated region，UTR)結合來降低CTNNA2基因的表達，并降低影響aN-catenin的表達抑制細胞黏附，促進減少食管癌細胞黏附，促進上皮-間充質轉化(EMT)。CTNNA2突變與胃癌細胞中與黏附功能障礙相關。αN-catenin通過抑制NF-κB信號通路調控下游白介素8(IL-8)、前列腺素內過氧化物合酶 (環加氧酶,PTGS)、血管細胞黏附分子1(VCAM-1)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等靶基因的表達，從而抑制神經母細胞瘤的生長和血管生成。研究人員證實CTNNA2是一種高突變的抑癌基因，他們首先通過外顯子檢測發現CTNNA2存在體細胞突變(CTNNA2-S132A和CTNNA2-E266*)。過表達CTNNA2突變體與敲低CTNNA2均抑制細胞生長和侵襲轉移，蛋白印跡法檢測和雙熒光素酶報告基因實驗證實，CTNNA2突變體蛋白的功能域結構改變，不能與β-catenin連接成細胞黏附蛋白細胞骨架，導致細胞質的β-catenin磷酸化入核，調控其靶基因TCF/LEF-1家族因子的轉錄，進一步上調生存素、c-Myc和細胞周期蛋白D1的表達[4]。然而，目前國內外尚未報道過CTNNA2在肝癌中的相關研究。

本研究從TCGA和HPA公共數據庫中發現， CTNNA2在HCC中基因和蛋白水平癌旁或正常肝中表達升高，并通過本研究中心的基因組學、轉錄組及蛋白組學實驗數據證實。臨床病理學特征分析發現CTNNA2蛋白組學的表達與門脈癌栓(P=0.040)，提示CTNNA2可能與肝癌的侵襲轉移可能相關。并且，在58例AFP陰性(<200 μg/L)肝癌患者中，51例(32%)患者在蛋白水平上表達陽性，其中20例患者為CTNNA2高表達，故CTNNA2的表達可作為腫瘤標志物用于AFP陰性的肝癌的輔助診斷。CTNNA2 mRNA和蛋白高表達的患者預后不佳,以上結果均提示，CTNNA2在肝癌中可能是一個癌基因。

但本研究的磷酸化組學結果顯示，HCC中β-catenin的Ser552殘基磷酸化水平較癌旁偏低(圖6A)，且CTNNA2高表達的HCC患者中β-catenin蛋白Ser552殘基的磷酸化水平偏低(圖6B)。因此，可以推斷β-catenin蛋白Ser552殘基的磷酸化并非CTNNA2調控肝癌發生發展的機制。本研究還首次檢測到CTNNA2蛋白多個磷酸化位點也發生變化(圖6C)，其具體的生物學功能需進一步驗證。

DNA甲基化修飾的異常是腫瘤基因組最常見的表觀遺傳學改變之一，主要表現為全基因組廣泛低甲基化與抑癌基因的高甲基化?；騿幼訁^的異常甲基化可以作為高靈敏度的腫瘤生物標志物用于腫瘤的早期診斷、療效觀察及預后判斷。HCC癌組織中CTNNA2啟動子區呈現去甲基化表現(圖6D)，癌組織中CTNNA2的高表達可能與啟動子區的低甲基化相關，但仍需進一步的實驗證實，且CTNNA2的甲基化水平作為腫瘤生物標志物也需要大樣本人群的驗證。

最后，免疫蛋白組學分析結果顯示，30種CTNNA2抗原多肽可與MHC-Ⅰ結合(圖8B)，表達豐度偏高的IFHQEKSK可作為候選腫瘤疫苗，但仍需后續合成多肽誘導CD8+T細胞活化和殺傷腫瘤靶細胞和動物體內實驗證實其免疫原性,并且在高表達CTNNA2的患者腫瘤和外周血中檢測針對相應抗原多肽的特異性T細胞。腫瘤免疫浸潤和T細胞有效殺傷是目前免疫治療成功的關鍵。過繼細胞療法(adoptive cell transfer，ACT)包括嵌合抗原受體T細胞免疫療法和T細胞受體(TCR)嵌合型T細胞(TCRT)療法。二者均通過基因改造的手段提高T細胞對特異性腫瘤細胞抗原的識別和殺傷[11-12]。Stadtmauer等[13]最新報道，利用CRISPR技術，敲除編碼內源性T細胞受體的TCRα和TCRβ以減少TCR的錯配明顯提高了其免疫原性。然而CART、TCRT、雙特異性抗體(bispecific T-cell engager，BiTE)等發揮的免疫增強作用均依賴于識別腫瘤細胞表面的特異性抗原，CTNNA2可作為理想抗原進一步進行基因工程改造，進而成為有效的腫瘤免疫治療手段之一[13-14]。

綜上所述，本研究首次發現CTNNA2在HCC中表達，為其可能作為HCC的腫瘤疫苗提供了初步的理論探討，然而，參與調控肝癌中CTNNA2基因的具體的生物學和免疫原性的功能有待后續進一步的實驗證實。