重組禽流感病毒三價滅活疫苗對鵝的免疫效果評估試驗

肖 杰，陳金仙

(廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東 廣州 511356)

高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)是由正粘病毒科A型流感病毒中的H5或H7亞型禽流感病毒引起的一種全身性或呼吸性的傳染病，屬于人畜共患病，被世界動物衛生組織規定為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[1]，常導致感染的家禽群體全部覆滅，甚至是感染人類后導致人的死亡，對家禽養殖業造成嚴重的經濟損失和危害人類的健康，而禽流感滅活疫苗是防控該病的關鍵所在[2]。預防和控制禽流感最有效的手段就是免疫接種，目前我國用于禽流感H9N2防控的疫苗多為滅活疫苗，所采用的佐劑多數為注射用礦物白油佐劑。免疫佐劑是指與抗原同時或先于抗原使用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力或改變免疫反應類型的物質[3]，而白油佐劑是目前獸用佐劑使用最為廣泛的佐劑。主要由礦物油、Span-80與硬脂酸鋁加熱溶解后形成的淡黃色油狀液體，與抗原乳化成W/O型乳液。它可以延緩免疫原在機體內的存留時間，使之持續緩慢釋放，增強巨噬細胞的吞噬能力。目前，白油Span佐劑雖然存在礦物油不可代謝的一些副作用，但由于出色的免疫效果，以及成本優勢，在獸用佐劑中無可替代。油乳劑滅活疫苗由于其具有完整的免疫原性和無毒力返祖現象，并且具有免疫效力高，使用安全，持續時間長等優勢，受到了廣大養殖戶的青睞。因此，注射用礦物白油作為一種佐劑被廣泛地應用于禽用滅活疫苗生產中。但是，不同廠家生產的注射用礦物白油佐劑黏度和純度等質量不一，其應激、免疫吸收和抗體消長效果差異較大，直接影響著疫苗的免疫效果[4]。因而選擇佐劑時不僅要考慮其免疫促進作用，也要兼顧佐劑的安全性及佐劑與抗原適當比例配制后疫苗的黏度、穩定性等是否符合要求[5]。礦物白油佐劑在獸用滅活疫苗上的應用研究開始于上世紀80年代，對預防控制畜禽重大疫病的傳播起到重要作用[6]。注射用礦物白油，其配制的滅活疫苗的共性問題是：如果注射用礦物白油的運動黏度系數高，則制備的滅活疫苗在免疫注射過程中出現黏稠度較大、注射困難、毒副反應較強(過敏)、引起注射部位紅腫、化膿、吸收慢、殘留量高，導致免疫動物生產和生長發育性能顯著下降等現象；運動黏度系數過低，則制備的滅活疫苗在免疫注射過程中出現黏稠度較小、吸收過快、毒副反應較強(過敏)，黏度過高過低均會引起大的應激問題，其本質與礦物白油佐劑的內在質量相關[7]。

為提高禽流感滅活疫苗的質量水平，本試驗采用了三種不同白油配制的禽流感滅活疫苗對肉鵝進行免疫效果綜合評估試驗，為禽流感滅活疫苗選擇合適的白油來配苗和對鵝的免疫方式提供實驗數據支持。

1 試驗材料

1.1試驗動物 廣東省廣州市花都區紅領巾農場養殖的同批次60日齡的鵝，共100羽進行免疫試驗。

1.2試驗疫苗 由廣東永順生物制藥股份有限公司生產的三批試驗疫苗，每批試驗疫苗均采用不同的白油佐劑進行配制，疫苗分別為試2020004批，試2020005批和試2020006批三批試驗疫苗。分別編為A、B、C三組對鵝進行免疫。三組試驗疫苗使用的白油佐劑占比如表1。

表1 A、B、C三組苗白油佐劑占比

1.3檢驗試劑 H5N1Re-11標準抗原(批號：20180823)、 H5N1Re-12標準抗原(批號：20180823)、H7N9H7-Re2標準抗原(批號：20180823)、H5N1Re-11標準抗病毒血清(批號2019004)、H5N1Re-12標準抗病毒血清(批號2019004)和H7N9H7-Re2標準抗病毒血清(批號2019004)均購置于哈爾濱維科生物技術開發公司。

健康公雞心臟血(無AI抗體)，配制洗滌用的1%紅細胞懸液，由廣東永順生物制藥有限公司生物實驗室制備。

2 試驗方法

2.1試驗動物分組 把100羽60日齡的鵝隨機分成10組，平均每組10羽。用疫苗A、B、C對三組鵝分別進行腿部肌肉注射，注射劑量為1 mL/羽，注射完畢后，將這三組鵝分別對應編組為A1、B1、C1，同理，對進行胸部肌肉注射的三組鵝分別對應編組為A2、B2、C2；進行頸部皮下注射的三組鵝分別對應編組為A3、B3、C3。最后一組鵝則注射1 mL的生理鹽水作為對照組。

2.2臨床觀察 對注射疫苗后鵝的表現狀況進行觀察，并詳細記錄鵝的飲食狀況、精神狀況、有無免疫反應副作用等。

2.3樣品采集

2.3.1在免疫前隨機抽取30羽鵝進行采血分離血清測定免疫前的HI抗體，并稱重計算每組鵝的平均體重。

2.3.2分別在免疫后21 d、28 d和35 d對每組鵝進行稱重并計算平均重和均增重，然后對每組鵝進行采血，分離血清測定HI抗體，同時每組每次取2羽鵝剖檢觀察注射部位的疫苗吸收狀況。

3 試驗結果

3.1免疫后鵝的死亡情況見表2。

表2 免疫后鵝的死亡情況

三組疫苗在腿部肌肉注射后的存活率均為100%，A、B疫苗在胸部和頸部肌肉注射的存活率分別為100%、100%、而C疫苗在胸部和頸部肌肉注射的存活率均為90%。

3.2免疫后增重見表3。

結果表明，各免疫組與對照組的體重增長基本無太大的差距，注射疫苗后疫苗接種組和沒有接種疫苗組鵝群的精神狀態無顯著差異(P>0.05)，免疫鵝精神食欲良好，無不良反映。

不同白油佐劑制備的疫苗在“腿部肌肉注射”的增重排序B1>C1>A1；不同白油佐劑制備的疫苗在“胸部肌肉注射”的增重排序A2>C2>B2；不同白油佐劑制備的疫苗在“頸部皮下注射”的增重排序C3>B3>A3；其中B2組的鵝在免后21 d狀態不佳，部分鵝有嘔吐粘液，所以B2組的鵝體重增長最差。

表3 免疫后鵝的增重情況

3.3鵝血清HI-GMT(nlog2)抗體結果統計見表4和圖1。

圖1 A、B、C三組試驗苗免疫后鵝血清HI-GMT抗體變化

肉鵝在免疫前，H5N1Re-11、H5N1Re-12、H7N9H7-Re2幾何平均抗體滴度均達到4log2 以上，說明這批試驗肉鵝有著比較強的母源性抗體。對禽流感疫苗免疫肉鵝21 d后，H5N1Re-11、H5N1Re-12、H7N9H7-Re2的幾何平均抗體滴度均達到6log2 以上，符合中華人民共和國重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活疫苗(H5N1Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re2株)制造及檢驗試行規程的要求。

在整個免疫期，三種抗體水平綜合評估由高到低分別是：B>C>A。不同免疫途徑的抗體水平由高到低分別是：頸部皮下注射>腿部肌肉注射>胸部肌肉注射。

表4 免疫后鵝血清HI-GMT抗體水平

圖2 免疫21 d后頸部皮下、腿部肌肉和胸部肌肉(自左至右)解剖情況

3.4解剖觀察疫苗的吸收情況 免后21 d，頸部皮下和腿部肌肉有少量疫苗殘留，而胸部肌肉基本無疫苗殘留；免疫28 d后均無疫苗殘留痕跡。

4 討論

試驗結果表明三種白油佐劑制備的重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活疫苗安全性和免疫效果都很好。肉鵝對疫苗的吸收從優到差分別是：A>B>C；不同免疫途徑肉鵝對疫苗的吸收從優到差分別是：胸部肌肉注射>腿部肌肉注射>頸部皮下注射。肉鵝免疫后存活率從高到低分別是：B=A>C；不同免疫途徑肉鵝免疫后存活率從高到低分別是：腿部肌肉注射>胸部肌肉注射=頸部皮下注射。疫苗使肉鵝產生HI抗體水平整體由高到低為：B>C>A。不同免疫途徑肉鵝免疫后產生HI抗體水平從高到低分別是：頸部皮下注射>腿部肌肉注射>胸部肌肉注射。

綜合評估B組(試2020005批)疫苗即使用100%道達爾EOLANE150：D3901F29白油佐劑制備的重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活疫苗對肉鵝的安全性和免疫效果最好，且最優的免疫途徑頸部皮下注射能更好地使肉鵝產生更高滴度的HI抗體和降低肉鵝對疫苗產生的免疫副反應。