改良非石蠟切片法熒光標記三維凝膠培養系統中形成的輸卵管內膜干細胞團*

林蕓秀 江明珠 閆 培 謝詹雄 林淑萍 葉浩峰 湯 璇 魏玉珍 楊信志△

（福建醫科大學，1 基礎醫學院，2 臨床醫學院，福州 350122）

細胞的聚團培養首先被Reynold 和Weiss[1]用于分離干細胞，隨后被應用于許多細胞的研究，如神經干細胞[1-2]、角膜干細胞[3-4]、腫瘤干細胞[5]等。所形成的細胞團細胞，無論是對其膜蛋白還是對其細胞核進行的免疫熒光染色來做定性的分析時，首先都需要對細胞團進行石蠟包埋切片[6]。這種石蠟切片技術要經過固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟等一系列復雜而耗時的程序，且這種較強烈的處理方法（有機試劑及較高的溫度）還會對細胞中的抗原有著一定程度的損害。雖然Weiswald 等[7]用非切片法對腫瘤細胞團進行了熒光免疫標記，利用多聚甲醛和Triton X-100 混合物同時固定和滲透細胞團塊，然后對所固定的細胞團塊進行脫水、抗體標記、制片、激光共聚焦觀察，但操作方法仍顯復雜。本研究改良了非切片法對細胞團細胞的熒光定性檢測方法，采用免疫熒光染色和非免疫熒光標記法標記三維凝膠培養系統中形成的輸卵管內膜干細胞團的細胞，利用冰甲醇直接固定細胞團塊樣本，對細胞團進行標記后，直接置于玻璃底培養皿上觀察，這種改良的方法省卻了脫水和制片的過程，使操作更加簡單、快速。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑

選用清潔級健康6～8周齡美國癌癥研究所選育的雌性小鼠30只，由福建醫科大學實驗動物中心提供。5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）試劑盒（Ribobio，廣州）；小鼠抗上皮特異性黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體（Servicebio，武漢）；山羊抗小鼠IgG（Abcam，英國）；水凝膠（Mebiol Gel，日本）；PrEGM BulletKit（Lonza，美國）。

1.2 輸卵管全細胞的準備

6～8周齡雌鼠斷頸處死后取輸卵管，去掉周圍的脂肪組織及系膜，用眼科鑷子撕碎，放入含有0.25 mg/mL 的膠原蛋白酶Ⅰ和Ⅱ的杜氏PBS（DPBS）中，37℃消化20 min，然后輕輕吹打使細胞分散，1 000 r/min 離心5 min加入5 mL 含10% FBS 的PrEGM 培養基懸浮細胞，然后通過直徑為40 μm 的細胞過濾器過濾掉沒有消化的組織團塊，分散的細胞懸浮液離心（1 000 r/min，5 min）后用含10% FBS 的PrEGM 培養液稀釋至細胞濃度為1×107/mL 的溶液備用。

1.3 水凝膠的準備

粉末水凝膠用商家建議的PrEGM 量稀釋，4℃環境中緩慢地搖動過夜，然后在4℃下靜置至少3 d備用。

1.4 細胞克隆團的培養和回收

取0.1 mL 上述備好的細胞懸浮液與0.9 mL 水凝膠溶液反復輕輕吹打混勻，然后取0.20～0.25 mL 的細胞-水凝膠混合溶液放入24 孔培養板中，37℃培養箱中靜置5 min 使凝膠凝固。然后加入1 mL 含10%FBS 的PrEGM BulletKit 在5% CO2，37℃培養箱中培養6 d。

培養6 d，把24孔培養板放置到冰上靜置5 min，使凝膠溶解。然后將凝膠溶液收集到15 mL的離心管中，1 000 r/min 離心3 min，用冷PBS 洗2次，每次1 000 r/min，3 min，收集細胞團備用。

1.5 EdU 插入培養

上述三維凝膠培養系統中形成的細胞克隆團培養至6 d，棄掉培養液，然后加入含10%FBS，50 μmol/L EdU 的PrEGM BulletKit 1 mL，繼續培養6 h，使EdU 插入到合成的DNA 中，然后回收細胞團備用。

1.6 Apollo 染色檢測EdU 標記的細胞核

EdU 插入培養的細胞團用-20℃甲醇固定過夜。室溫環境中加入Apollo 反應液并輕輕搖晃6 h，使其與插入的EdU 反應均勻，然后用Hoechst33342染細胞核，避光保存待觀察。

1.7 免疫熒光標記檢測細胞團細胞的膜蛋白EpCAM

上述步驟（1.4）獲得的細胞克隆團用-20℃的甲醇固定5 h，然后用含有0.2%Triton X-100 的冷PBS（PBST）洗2次，將細胞克隆團放入含10%山羊血清的PBST 中封閉孵育3 h，加入含anti-EpCAM 的PBST溶液（1∶200），4℃冰箱內過夜孵育。用含1%山羊血清的PBST 清洗2次，每次5 min，1 000 r/min 離心5 min。細胞團沉淀用含山羊抗小鼠IgG 二抗的PBST（1∶400）室溫培養2 h，PI 復染細胞核后將樣本避光保存。

1.8 激光共聚焦顯微觀察熒光標記情況

所有避光保存的樣本運到激光共聚焦顯微觀察室，觀察之前，將50μL 的樣本懸浮液放入玻璃底培養皿中，置于共聚焦顯微鏡載物臺上靜置1～2 min，觀察并拍照。

2 結果

2.1 克隆細胞團在三維凝膠培養系統中的形成

利用單個分散的輸卵管全細胞在凝膠中培養6 d。培養第0天，可見單個細胞均勻分散在凝膠中（圖1A，見封三）；由于凝膠可以阻止細胞遷移，因此，凝膠培養系統可防止細胞聚集現象。培養至第3 天時，具有增殖能力的細胞在原位分裂增殖，并形成了由單個細胞增殖而來的較小的細胞克隆團（圖1B，見封三），這些小細胞克隆團在繼續培養到第6 天時逐漸長大，形成圓球形細胞克隆團塊（圖1C，見封三）以及培養6 d凝膠解聚回收的細胞團（圖1D，見封三）。

2.2 非免疫熒光EdU 染色對細胞團S 期細胞的標記

EdU 的標記結果顯示細胞團中的很多細胞被標記成陽性（圖2A～C，見封三），熒光分布在細胞核中，說明細胞團中的細胞有著明顯的分裂增殖活動，表明EdU 可以通過非切片法被用來標記細胞團細胞的增殖情況（圖2D～F，見封三）。

2.3 對細胞團細胞表面抗原的熒光標記

因為輸卵管內膜干細胞明確表達EpCAM，因此以EpCAM 作為細胞團細胞的表面抗原，從而對其進行免疫熒光標記來驗證非切片法熒光染色的適用情況。結果顯示，凝膠培養形成的細胞團都有表達EpCAM，而且染色也比較均勻、強烈（圖3A～C，見封三），陰性對照（圖3D～F，見封三）為一抗空白組。說明非切片的免疫熒光染色方法可以用于定性鑒定細胞團細胞的膜蛋白的表達。

3 討論

三維凝膠培養系統，越來越多地被用來培養和擴增細胞[8-10]。由于凝膠的特點，細胞在凝膠培養過程中不會發生遷移而聚集[11]。因此培養得到的細胞團是由單個細胞增殖而形成，并且這些細胞有著較強的分裂增殖能力。而輸卵管內膜干細胞在三維凝膠培養系統中可以形成細胞團，這種強烈的增殖能力也被認為是干細胞的自我更新能力[5，12]。

對細胞團細胞的定性分析，傳統的方法是切片法。雖然有研究用非切片技術對腫瘤細胞的細胞團進行免疫熒光觀察，但其程序略顯復雜，在對細胞團細胞進行固定后，還要對其進行逐步脫水，在對細胞團染色之后，要將樣本吸附至玻片，吸掉多余的液體，再用90%的甘油重新懸浮，再置于載玻片和蓋玻片之間由雙面膠圍成的間隙內，蓋上蓋玻片后用膠封片觀察[7，13]。本實驗用冰甲醇對細胞團細胞進行固定，不需要脫水的步驟，在對三維凝膠培養系統中所形成的干細胞團進行非免疫和免疫熒光染色，然后將樣本懸浮液直接置于NEST 玻璃底細胞培養皿中進行觀察，得到了良好的觀察效果。

對形成細胞團的干細胞自我更新能力的鑒定，傳統的方法是用BrdU 插入復制期的染色質中，然后用抗BrdU 的抗體來標記[6，14]。這種方法需要在處理的過程中對樣本石蠟包埋、切片、脫蠟、DNA 變性等一系列復雜的處理。而EdU 是近10年來新出現的鑒定細胞增殖能力的技術，EdU 可以代替DNA 中的胸腺嘧啶（T），EdU 可以插入到復制DNA 鏈中，在Cu+催化下與熒光標記的小分子疊氮化合物探針反應，快速生成穩定的三唑環，并發出熒光。與BrdU 檢測方法相比，EdU 檢測方法更快速、更靈敏、更準確。EdU 與T 非常相似，而且EdU 染料只有BrdU 抗體的1/500，在細胞內很容易擴散，無需DNA 變性（酸解、熱解、酶解等）處理，可有效避免樣品損傷，而且無需抗原抗體反應，能在細胞和組織水平更快速便捷地反映DNA 復制活性[15-16]。因此，用EdU 標記干細胞，可以說明干細胞的自我更新能力。一般而言，細胞的EdU 標記都是對貼壁的單層細胞進行標記觀察或細胞懸浮液標記后用流式細胞儀進行分析。本實驗用EdU 對細胞團的細胞核進行標記，并且在細胞團內直接觀察，并得到了良好的結果。本實驗對細胞團的染色結果表明，細胞團內的部分細胞的細胞核為EdU 陽性，揭示細胞團的部分細胞具有自我更新的能力，因此本研究直接對細胞團的染色方法可以用來鑒定細胞的增殖能力。結果顯示，并不是全部的細胞都呈EdU 陽性，說明細胞團內的細胞在標記期間并不是都處于DNA 復制期，或者有些干細胞在增殖的過程中也逐漸分化，從而失去了自我更新的能力。本研究利用改良的非切片方法第一次對細胞團塊進行EdU 標記的結果進行了觀察，結果表明這種染色方法對EdU 標記的觀察是可行的。

本實驗所使用的三維凝膠培養系統中形成的細胞克隆團，被證明是由單個輸卵管內膜干細胞增殖而成[17]。這些細胞都明確表達輸卵管內膜干細胞的一個膜蛋白標記物分子EpCAM。因此，選用非石蠟切片方法標記這些細胞團中細胞膜上的EpCAM，檢測這種改良的非切片法是否適合膜蛋白的免疫熒光染色。

對細胞團的免疫熒光分析，傳統的方法也是對細胞團進行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟等一系列較強的物理和化學的處理，這種處理方法會在一定程度上破壞細胞的原有結構，從而使染色結果在一定程度上失真。用非切片法可以對細胞團直接染色，避免了對細胞樣本的強處理，使細胞結構以及組織結構在最大限度上得以保留，膜蛋白等抗原物質也受到了最大限度的保護，因此，這種方法的染色會最大限度反映活細胞的真實結構。另一方面，這種染色方法還可以用激光共聚焦顯微鏡來掃描細胞團各個層次的結構，從而更加全面地掌握細胞團細胞的分布情況及性質。利用改良的非切片方法對細胞膜蛋白EpCAM 進行免疫熒光標記，EpCAM 在這些細胞膜上都有強表達，并且可以觀察到EpCAM均勻地分布在細胞膜上，說明這種改良的非石蠟包埋的免疫熒光染色方法可以被用來對細胞團細胞的膜蛋白進行免疫熒光分析。由于細胞團的細胞高度密集相互影響，普通熒光顯微鏡不能很好地觀察細胞結構，而激光共聚焦顯微鏡卻能很好地分辨出細胞團內的細胞結構[18]。

綜上所述，通過對細胞團的細胞核化學反應法染色以及對細胞膜的非切片的免疫熒光染色法的檢測，證明了改良后的非切片法可以利用激光共聚焦顯微鏡很好地用于對細胞團塊細胞的定性分析。

圖版說明（圖見封三）

圖1 輸卵管細胞在三維凝膠培養系統中形成了細胞團，標尺=50 μm。分散的輸卵管細胞在凝膠中培養第0、3 和6 天的情況（A～C）以及第6 天低溫解聚凝膠后收集到的細胞團（D）.

圖2 EdU標記輸卵管內膜干細胞團，標尺=25 μm。EdU 插入到細胞團中處于S 期的細胞核內（A～C）和無EdU 插入的陰性對照（D～F）.

圖3 非切片處理法對細胞團細胞進行免疫熒光染色，標尺=50 μm。用小鼠EpCAM 抗體對細胞團進行了免疫熒光染色，細胞團被均勻地染色并發出清晰的熒光（A～C），陰性對照（D～F）為一抗空白組.