半胱氨酸蛋白酶抑制劑C對局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)caspase-9、腦紅蛋白表達和過氧化損傷的影響*

陳 萌 梁秀軍 吳曉光，5 馬凱旋 陳元操

（承德醫(yī)學(xué)院，1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡室，2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，3 2016級臨床本科，4 2014級臨床本科，5 河北省神經(jīng)損傷與修復(fù)實驗室，承德 067000）

缺血性腦血管疾病對人類健康造成的危害日趨嚴重，尋找有效方法加強對缺血性腦血管疾病的防治尤為重要。缺血性腦卒中的主要病理過程是腦部缺血再灌注損傷。因此，改善腦缺血再灌注造成的損傷是亟需解決的問題[1]。腦紅蛋白（neuroglobin，NGB）是一類球蛋白，這種蛋白主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦內(nèi)神經(jīng)元，它與腦內(nèi)氧的運輸、貯備和利用密切相關(guān)[2-4]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cysteinyl aspartate-specific protease-9，caspase-9）是位于caspase級聯(lián)反應(yīng)上游的啟動性蛋白酶，與細胞凋亡的關(guān)系非常密切。研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（cystatin C，CysC）能在一定程度上降低缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡，對神經(jīng)元的保護有較好的作用[5-7]。本實驗通過給予藥物CysC預(yù)處理腦缺血再灌注損傷的實驗大鼠，研究其對損傷后大腦皮質(zhì)組織caspase-9、NGB的表達及自由基損傷和形態(tài)學(xué)的影響，以期為腦缺血再灌注損傷的預(yù)防及治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

CysC（purified）購自瑞士Enzo Life Science，（貨號BML-SE479-0100，批號：12101509）；一抗兔抗caspase-9 單克隆抗體（美國Abcam 公司，貨號ab-32539，批號：YH100912D）；兔抗NGB 多克隆抗體（美國 Proteintech 公司，貨號：13499-1-AP）；Alexa Fluor?594 -羊抗兔IgG（美國Life Technologies，貨號：A-11072）；兔SP 試劑盒（北京中杉金橋，兔鏈霉素卵白素-生物素法檢測系統(tǒng)，貨號SP-9001，批號：16183A03）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔 IgG（美國KPL，貨號074-1506-50，批號：140012）；BCA法蛋白定量試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，貨號70-M-PQ0012，批號：4219150）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（南京建成，貨號A001-1，批號：20170612）；丙二醛（malondialdehyde，MDA，南京建成，貨號A003-1-100，批號：20170608）；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX，南京建成，貨號A005-1，批號：20170612）；蛋白定量試劑盒購自南京建成（貨號A045-2，批號：20170602）；石蠟切片機（德國Leica 公司，型號 RM2235）；超薄切片機（德國Leica 公司，型號 EM UC6）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica，型號DMI4000B）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司，型號 H-7650）。

1.2 動物分組及模型建立

成年SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自北京維通利華生物技術(shù)有限公司。大鼠按照隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組（Sham），腦缺血再灌注組（I/R），CysC 低（2 mg/L）、中（5 mg/L）、高濃度組（10 mg/L），每組18只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，用10%水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg）。I/R組和CysC 各組參照Longa 法建立右側(cè)局灶性腦缺血再灌注損傷模型[8]。Sham組僅分離右側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動脈，不插入漁線。術(shù)后燈照保暖，缺血2 h拔出線栓至頸外動脈殘端實現(xiàn)再灌注。

1.3 H-E染色觀察形態(tài)學(xué)變化

再灌注24 h用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，每組取6只。先用生理鹽水約300 mL 進行快速灌流，再用4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液（200 mL）先快后慢進行全身灌流固定。取腦后置于4%多聚甲醛中后固定24 h。常規(guī)脫水，石蠟包埋后于石蠟切片機上進行連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。常規(guī)脫水后行H-E染色，光鏡下觀察大鼠腦組織神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測caspase-9 陽性細胞數(shù)

包埋塊于石蠟切片機中進行連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，3% H2O2室溫15 min 滅活內(nèi)源性過氧化物酶。取檸檬酸鹽緩沖液加入微波盒中，加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于已沸騰的緩沖液中，中檔處理10 min，取出自然冷卻后用PBS 沖洗。滴加正常山羊血清室溫封閉15 min棄去，勿洗。滴加兔抗caspase-9單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜。次日取出室溫放置30 min，洗片后滴加生物素標記山羊抗兔IgG，37℃孵育10 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵蛋白工作液37℃孵育10 min。PBS 沖洗后DAB 顯色，不同濃度的乙醇脫水、二甲苯透明后用中性樹膠封片。光鏡下觀察染成棕黃色顆粒的陽性細胞，各組分別于200倍視野下選取5個互不重疊視的區(qū)域進行拍照。計算陽性細胞數(shù)目，取其平均數(shù)。

1.5 免疫熒光染色檢測NGB 陽性細胞

石蠟切片經(jīng)二甲苯常規(guī)脫蠟后梯度乙醇水化，室溫下加入0.25% Triton X-100 進行處理。PBS 搖洗后用蒸餾水浸泡切片5 min。切片在檸檬酸緩沖液中進行抗原修復(fù)，溫度在95℃～98℃，時間20 min。切片在修復(fù)液中恢復(fù)至室溫后取出，放置于PBS 中浸泡5 min。用10%正常山羊血清封閉1 h，加入兔抗NGB 多克隆抗體（1：200 稀釋），4℃過夜。次日，冰箱中取出于室溫下放置30 min，PBS 洗片后滴加（1∶500 稀釋）Alexa Fluor?594-羊抗兔IgG 熒光二抗，避光孵育1 h。PBS 避光搖洗，終止染色。緩沖甘油封片濃度為50%，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。用PBS 作為陰性對照，其余步驟同上。每張切片在皮質(zhì)區(qū)隨機取5個不重疊的視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，取其均數(shù)。

1.6 免疫印跡檢測大腦皮質(zhì)caspase-9 蛋白表達

將各組實驗大鼠（每組6 只）大腦皮質(zhì)經(jīng)RIPA 裂解液于冰上裂解并及時勻漿。低溫離心后取上清液，BCA 法進行蛋白定量。嚴格按照試劑說明書經(jīng)過SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗兔抗 caspase-9 抗體（1 ∶1 000），4℃孵育過夜。次日洗膜后加入對應(yīng)的二抗HRP 標記的羊抗兔IgG（1 ∶5 000）室溫孵育1 h，曝光顯影條帶。用圖像分析軟件IPP 6.0 測定條帶的灰度值，測定并計算出caspase-9 與內(nèi)參β-actin 的比值，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 大腦皮質(zhì)組織生化指標的測定

其余各組大鼠按上述方法進行麻醉，于冰盤上切除小腦和腦干部分后分離右側(cè)半球，取損傷大腦皮質(zhì)。先用預(yù)冷的生理鹽水中漂洗腦皮質(zhì)組織，然后濾紙試干，進行稱重。用生理鹽水按1：9 的比例將其配成10%的腦組織勻漿液，低溫離心機4℃離心10 min（3 500 r/min）后提取上清液。采用考馬斯亮藍法進行腦組織勻漿液的蛋白定量，按照試劑盒說明書分別進行 SOD 活力、MDA含量和GSH-PX 活力的測定。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料采用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05 時表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦缺血再灌注后病理形態(tài)學(xué)的變化

Sham組神經(jīng)元形態(tài)正常，染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰，無水腫；胞核藍染，胞質(zhì)紅染。高倍鏡下核大而圓，核仁清晰。I/R組損傷區(qū)域正常結(jié)構(gòu)模糊不清紊亂，水腫極為嚴重；核固縮深染，可見呈篩狀的壞死灶。CysC低、CysC中濃度組有不同程度的改善，水腫減輕，有少量細胞核發(fā)生核固縮和碎裂。而CysC高濃度組則形態(tài)變化明顯，有較多神經(jīng)細胞呈片狀分布，染色變淺，胞核固縮，甚至核仁消失、胞質(zhì)溶解（圖1，見封二）。

2.2 Caspase-9 陽性細胞

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示caspase-9 主要表達于細胞質(zhì)，胞核也有表達，呈棕黃色或棕褐色。Sham組有極少量的陽性細胞，I/R caspase-9陽性細胞增多（P＜0.01），CysC低、CysC中濃度組caspase-9 陽性細胞較I/R組明顯減少（P＜0.01），而CysC高濃度組陽性細胞數(shù)明顯增多（表1，圖2，見封二）。

2.3 NGB 免疫熒光顯色

Sham組大鼠大腦有一定量的NGB陽性細胞，呈紅色熒光，主要分布在神經(jīng)元的胞漿；I/R組損傷側(cè)腦皮質(zhì)中NGB陽性細胞數(shù)增多（P＜0.01）。CysC低濃度組和CysC中濃度組 NGB陽性細胞數(shù)較I/R組明顯增多（P＜0.01）。CysC高濃度組NGB陽性細胞數(shù)較CysC低濃度組和CysC中濃度組顯著減少（P＜0.01）；CysC高濃度組與I/R組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1，圖3，見封二）。

表1 各組大腦皮質(zhì)caspase-9 和NGB 陽性細胞數(shù)比較（n=6，±s）

表1 各組大腦皮質(zhì)caspase-9 和NGB 陽性細胞數(shù)比較（n=6，±s）

*P＜0.01 vs 假手術(shù)組；△P＜0.01 vs I/R 缺血再灌注組；#P＜0.01 vs CysC低濃度組

組別 Caspase-9 陽性細胞數(shù) NGB 陽性細胞數(shù)假手術(shù)組 3.33±1.03 65.00±3.74缺血再灌注組 61.50±2.43*# 88.00±5.48*#CysC低濃度組 44.17±2.32*△ 168.00±5.76*△CysC中濃度組 28.33±2.42*△# 199.50±7.15*△#CysC高濃度組 54.67±3.50*# 87.83±5.95*#

2.4 Caspase-9 蛋白表達的變化

免疫印跡檢測結(jié)果顯示：Sham組有較少caspase-9表達；I/R組caspase-9表達升高，CysC低、CysC中濃度組caspase-9 的表達較I/R組有不同程度的減少（P＜0.01）；而CysC高濃度組caspase-9 的表達較CysC低濃度和CysC中濃度組明顯升高（P＜0.01）（圖 4）。

圖4 各組caspase-9 相對表達水平

2.5 損傷側(cè)大腦皮質(zhì)SOD 和GSH-PX 活力、MDA含量的變化

與Sham組比較，I/R組與CysC低、中濃度組大鼠SOD和GSH-PX活力降低，MDA含量增高（P＜0.01），CysC高濃度組SOD和GSH-PX活力升高，MDA含量降低；與I/R組比較，CysC低、CysC中濃度組SOD和GSH-PX活力增高，MDA含量降低（P＜0.01），CysC高濃度組SOD和GSH-PX活力明顯降低，MDA含量顯著增高（表2）。

3 討論

缺血性腦卒中的原因是由于供應(yīng)腦部血液的動脈發(fā)生閉塞性病變，沒能得到及時的側(cè)支循環(huán)，使腦組織代謝發(fā)生供不應(yīng)求所致。缺血性腦卒中的發(fā)病率、致殘率和病死率均較高，占腦卒中總數(shù)的60%～70%，且大多數(shù)患者會遺留有不同程度的癱瘓、失語等殘疾[9-10]。

腦缺血再灌注損傷后觸發(fā)了氨基酸毒性、自由基生成、蛋白酶激活、炎癥反應(yīng)等一系列的級聯(lián)反應(yīng)。其最終階段涉及到caspase介導(dǎo)的細胞凋亡[11-12]，caspase在細胞凋亡的過程中處于中心地位，屬于啟動性一類，它的激活方式代表了caspase激活的最典型方式，也就是線粒體途徑[13]。裴海濤等[14]研究顯示，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7明顯抑制了缺血再灌注誘導(dǎo)的皮質(zhì)區(qū)caspase-9蛋白及caspase-9 mRNA 的表達，通過下調(diào)caspase-9表達，抑制線粒體凋亡途徑來減少神經(jīng)元凋亡的數(shù)目，進而起到對腦缺血再灌注損傷的保護作用。

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)SOD、GSH-PX 活力和MDA含量（n=6，±s）

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)SOD、GSH-PX 活力和MDA含量（n=6，±s）

*P＜0.01 vs 假手術(shù)組，△P＜0.01 vs 缺血再灌注組，#P＜0.01 vs CysC低濃度組

組別 SOD（U·mg-1·pro-1）GSH-PX（U·mg-1·pro-1）MDA（nmol·mg-1·pro-1）假手術(shù)組 136.73±14.26 113.93±8.33 5.87±1.13缺血再灌注組 71.50±9.53*# 42.81±6.97*# 14.13±0.95*#CysC低濃度組 101.64±7.62*△ 67.22±4.10*△ 11.15±0.59*△CysC中濃度組 120.47±5.30*△# 83.77±6.18*△# 9.15±1.03*△#CysC高濃度組 80.62±9.10 *# 45.31±6.36*# 13.42±1.64*#

國外研究學(xué)者于2000年在哺乳動物的大腦首次發(fā)現(xiàn)了一種新的球蛋白，這種新的蛋白被稱為NGB[2-4]。NGB 主要在神經(jīng)系統(tǒng)表達，與氧有很高的親和力，能可逆性的與氧分子結(jié)合，并特異性向腦組織供氧，被稱為神經(jīng)元內(nèi)的呼吸球蛋白[15]。Khan 等[16]研究顯示，腦組織中NGB 的表達增加可以降低轉(zhuǎn)基因小鼠的腦梗死體積，提示NGB 在腦缺血缺氧性損傷中對神經(jīng)元有保護作用。另一方面，NGB 與氧有較高的親和力具有抗氧化作用。有文獻證實NGB 是一種毒性物質(zhì)的清道夫，它清除缺氧性腦病患者體內(nèi)的氧化產(chǎn)物，如NO、H2O2、O2-等[17]。Brunori 等[18]報道NGB 具有結(jié)合NO 和減輕NO 毒性的作用，推測它具有清除活性氧自由基的作用。當(dāng)NGB 與CysC 二聚體結(jié)合后抑制其胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，可以發(fā)揮其抗氧化的作用。

因此，本實驗預(yù)防性給予藥物CysC 處理腦缺血再灌注模型大鼠，研究不同濃度的CysC 對各組大鼠凋亡蛋白caspase-9、NGB 和自由基損傷的影響。免疫印跡結(jié)果顯示，在CysC低、中濃度組中，隨著CysC 藥物濃度的升高，caspase-9表達較I/R組明顯減少，這和caspase-9 免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果吻合。NGB 免疫組化實驗結(jié)果顯示Sham組因僅做頸動脈分離，沒有腦組織低氧造成的NGB 應(yīng)激性增高。在缺血再灌注24 h，皮質(zhì)損傷半暗帶區(qū)由于腦缺血缺氧導(dǎo)致NGB 合成增加；CysC低、中濃度組與I/R組相比，NGB 陽性細胞數(shù)顯著增多。因藥物作用促使NGB 增高更加明顯，增加的NGB 可能促進氧氣向神經(jīng)元線粒體擴散及傳遞，以確保線粒體產(chǎn)生能量的需要。同時可顯著提高損傷區(qū)腦皮質(zhì)組織SOD 及GSH-PX 活力，降低MDA含量，減輕了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用。而CysC高濃度組NGB 數(shù)量明顯減少，同時SOD 及GSH-PX 活力降低，MDA含量增高。神經(jīng)細胞更容易受到影響，加速了細胞的死亡。曾有學(xué)者在大鼠海馬區(qū)注射較高濃度的CysC，顯示高濃度的CysC 聚集在腦組織中可能會誘導(dǎo)神經(jīng)細胞死亡，具有神經(jīng)毒性[19-20]。這也與本實驗中的結(jié)果相符合。本實驗高濃度的CysC 未能改善缺血再灌注引起的腦損傷，可能與CysC 濃度過高所致神經(jīng)毒性有一定的關(guān)系。

綜上所述，適量濃度的CysC 可通過上調(diào)NGB表達，下調(diào)caspase-9 的表達，減少自由基濃度，模擬腦缺血預(yù)適應(yīng)的生物效應(yīng)，從而改善大鼠局灶性腦缺血再灌注造成的神經(jīng)元損傷；而CysC 使用濃度過高時則對I/R 腦組織造成損害，具有一定的毒性作用。

圖版說明（圖見封三）

圖1 各組缺血再灌注側(cè)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，H-E染色，標尺=50 μm。A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：CysC低濃度組；D：CysC中濃度組；E：CysC高濃度組.

圖2 各組大鼠大腦皮質(zhì)caspase-9 蛋白免疫組織化學(xué)顯色，標尺=50 μm。A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：CysC低濃度組；D：CysC中濃度組；E：CysC高濃度組.

圖3 各組大鼠大腦缺血再灌注后NGB 免疫熒光顯色，標尺=50 μm。A1～A3：假手術(shù)組；B1～B3：缺血再灌注組；C1～C3：CysC低濃度組；D1～D3：CysC中濃度組；E1～E3：CysC高濃度組.