磺胺嘧啶鋅軟膏聯(lián)合依諾沙星軟膏對(duì)燙傷感染小鼠菌落數(shù)及愈合的影響

（鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院燒傷整形科，洛陽 471000）

燙傷后皮膚組織的防御功能破壞，導(dǎo)致病灶處皮膚組織及細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死，細(xì)菌更容易長(zhǎng)時(shí)間定植[1]。因此，有效控制燙傷后細(xì)菌感染，對(duì)于加快皮膚愈合具有重要意義。目前，燙傷后感染的細(xì)菌以銅綠假單胞菌最為常見。近些年，在燙傷病灶檢測(cè)細(xì)菌陽性率已經(jīng)是臨床主要檢測(cè)方式[2]。燙傷后機(jī)體血清中鋅水平降低，導(dǎo)致創(chuàng)面組織再生能力降低，需要通過增加外源性鋅水平，從而加快創(chuàng)傷皮膚組織愈合和上皮細(xì)胞繁殖[3]。依諾沙星（Enoxaein，ENX）為唆諾酮類抗菌藥，對(duì)多重耐藥的腸桿菌科仍能降低銅綠假單胞菌耐藥，加快殺菌能力，提高抗菌作用。磺胺嘧啶鋅主要成分為磺胺嘧啶和鋅，磺胺嘧啶抗菌作用較好，鋅能夠提高皮膚組織再生[4]，但鮮有采用該藥物對(duì)燙傷感染創(chuàng)面菌落及愈合率的研究。本研究通過建立燙傷感染小鼠模型，觀察磺胺嘧啶鋅軟膏聯(lián)合依諾沙星軟膏對(duì)其療效影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)菌株、主要藥物和試劑

SPF級(jí)BALB/c 小鼠（遼寧生物技術(shù)）；銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控株A TCC27853（上海北諾生物）；LB 營養(yǎng)瓊脂（上海博湖生物）；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）抗體（北京百普賽斯生物）；戊巴比妥鈉、多聚甲醛（安徽豐源生物）；蘇木精伊紅試劑盒（北京諾博萊德科技）；ELISA 試劑盒（上海撫生實(shí)業(yè)）。

1.2 燙傷模型建立

將所有小鼠采用2%戊巴比妥鈉按照40～60 mg/kg 麻醉后脫毛，面積約25 cm2，麻醉后，將大鼠固定到自制的燙傷板上，后將模板置于點(diǎn)熱恒溫的水浴鍋上，100℃的沸水持續(xù)燙傷15 s，用紗布擦拭干凈，形成Ⅱ級(jí)燙傷。

1.3 新鮮菌液和普通肉湯瓊脂培養(yǎng)皿的制備

將-80℃冷藏的ATCC27853 菌群，復(fù)蘇后接種到1.5%瓊脂的肉湯培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)，用接種環(huán)挑選幾個(gè)菌落，置于無菌EP 中，濃度為1×10 CFU/mL，后取瓊脂粉和肉湯培養(yǎng)基，溶于高溫蒸餾水中，加熱后溶解，充分溶解后封口，滅菌后，自然冷卻后備用，

1.4 感染模型建立、分組及用藥方法

所有小鼠取銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控株A TCC27853 在創(chuàng)傷處進(jìn)行輕輕擦刮涂抹1 min，菌液完全吸收后。隨機(jī)分為3組，模型組、對(duì)照組和干預(yù)組，每組7 只小鼠。藥物干預(yù)：均在接種1 d后開始藥物干預(yù)，對(duì)照組采用依諾沙星軟膏（中國福建金生只要股份有限公司；20043570，規(guī)格：10 g：0.1 g），1 d 2次；干預(yù)組在依諾沙星軟膏均勻涂抹后形成白色膜采用磺胺嘧啶鋅軟膏（河南全宇制藥股份有限公司，H41022525，規(guī)格：20 g），1 d 2次后采用無菌紗布覆蓋，紙膠布固定，基礎(chǔ)組采用凡士林干預(yù)，3組均治療8 d。

1.5 菌落計(jì)數(shù)、感染創(chuàng)面愈合率及愈合時(shí)間變化

分別在治療后1、4 d 和8 d 時(shí)膠頭滴管取少量生理鹽水由創(chuàng)面的一端滾動(dòng)至另一端，放入無菌EP管中。稀釋后，采用不同濃度的菌液均勻分布在6 cm 的普通肉湯瓊脂培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

分別在治療后1、4 d和8 d時(shí)，采用紙片方框固定創(chuàng)面面積尺寸，每天拍照觀察進(jìn)行創(chuàng)面愈合程度及愈合時(shí)間，采用 IPP 6.0圖形分析軟件進(jìn)行分析。

1.6 H-E染色檢測(cè)病理變化

隨機(jī)頸部脫臼處死4 只小鼠，取創(chuàng)面組織，甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋后，H-E 蘇木精染色，中性樹膠封固。觀察組織病理變化。

1.7 ELISA 檢測(cè)炎性指標(biāo)

治療結(jié)束后，剩余小鼠抽取眼眶靜脈血2 mL，檢查白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達(dá)，按照ELISA 說明術(shù)進(jìn)行操作，離心20 min，加入100 μL 樣本37.5℃進(jìn)行沖洗，靜置60 min，檢測(cè)炎癥因子水平。

1.8 免疫印跡檢測(cè)創(chuàng)傷組織中CTGF 蛋白表達(dá)

創(chuàng)傷組織加入蛋白裂解液，離心，后將取得溶液加入上樣孔。電泳后，取下PVDF 膜TBS 浸泡10 min，密封，PBS 反復(fù)沖洗，然后加一抗（1∶500），40℃雜交1 d，重復(fù)上述清洗步驟，加入二抗（1∶2 000），雜交2 h。將膜浸入ECL 工作液，隨后進(jìn)行檢測(cè)，獲取電泳圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組菌落計(jì)數(shù)創(chuàng)面愈合率及時(shí)間、病理、血清炎癥因子、CTGF 蛋白表達(dá)以±s表示，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠創(chuàng)面菌落計(jì)數(shù)比較

3組在治療1 d 時(shí)創(chuàng)面菌落計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)照組及干預(yù)組在4 d 和8 d 創(chuàng)面菌落計(jì)數(shù)低于模型組（P＜0.05），干預(yù)組與對(duì)照組創(chuàng)面菌落數(shù)量相差較小（P＞0.05）；每組多個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，干預(yù)組及對(duì)照組隨著時(shí)間增加，菌群數(shù)量減少（P＜0.05）；創(chuàng)面愈合率2組治療1 d 時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），對(duì)照組在治療4 d 和8 d 時(shí)創(chuàng)面愈合率低于干預(yù)組（P＜0.05）；每組多個(gè)時(shí)間比較，愈合率均隨著時(shí)間增加而升高（P＜0.05）；愈合時(shí)間干預(yù)組高于對(duì)照組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組小鼠創(chuàng)面菌落計(jì)數(shù)比較（n=7，±s）

表1 各組小鼠創(chuàng)面菌落計(jì)數(shù)比較（n=7，±s）

*P＜0.05 vs 模型組

組別 1 d 4 d 8 d模型組 4.74±0.45 4.67±0.47 4.90±0.55對(duì)照組 4.58±0.49 3.82±0.34* 3.62±0.42*干預(yù)組 4.68±0.42 3.77±0.35* 3.55±0.43*

2.2 各組小鼠創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間比較

創(chuàng)面愈合率2組治療1 d 時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），對(duì)照組在治療4 d 和8 d 時(shí)創(chuàng)面愈合率低于干預(yù)組（P＜0.05）；每組多個(gè)時(shí)間比較，愈合率均隨著時(shí)間增加而升高（P＜0.05）；愈合時(shí)間干預(yù)組短于對(duì)照組（P＜0.05）（表2）。

表2 各組小鼠創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間比較（n=7，±s）

表2 各組小鼠創(chuàng)面愈合率和愈合時(shí)間比較（n=7，±s）

*P＜0.05 vs 對(duì)照組

組別 愈合率（%）愈合時(shí)間（d）1 d 4 d 8 d對(duì)照組 7.03±5.03 15.35±6.49 21.55±6.40 33.67±1.57干預(yù)組 10.47±4.77 22.09±7.39* 30.79±8.45* 28.65±1.37*

2.3 各組小鼠創(chuàng)面組織病理比較

對(duì)照組創(chuàng)傷組織炎癥改善，壞死組織減少，干預(yù)組肉芽組織生長(zhǎng)活躍，皮膚組織結(jié)構(gòu)較完整，無顯著炎癥浸潤（圖1）。

2.4 治療后各組小鼠血清炎癥因子水平比較

對(duì)照組小鼠血清中IL-16、IL-10 和TNF-α 水平高于干預(yù)組（P＜0.05）（表3）。

表3 治療后各組小鼠血清炎癥因子水平比較（±s）

表3 治療后各組小鼠血清炎癥因子水平比較（±s）

#P＜0.05 vs 對(duì)照組

組別 IL-6 IL-10 TNF-α對(duì)照組 303.35±38.09 231.41±24.50 122.89±14.09干預(yù)組 102.45±24.66* 155.49±17.83* 84.38±12.39*

2.5 創(chuàng)傷組織的CTGF 蛋白表達(dá)變化

CTGF 蛋白分子量為38 kD，干預(yù)組小鼠創(chuàng)傷組織中CTGF 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖2）。

2.6 磺胺嘧啶鋅軟膏聯(lián)合依諾沙星對(duì)燙傷小鼠模型愈合的影響

第1天兩組創(chuàng)面有漿液滲出，并伴有紅腫現(xiàn)象；第7 天滲出液開始凝固、干燥，形成痂皮，創(chuàng)面面積見縮小創(chuàng)面邊緣部分區(qū)域；第14天，肉芽組織明顯呈向心性、團(tuán)塊狀、瘤性增生（圖3）。

3 討論

燙傷感染創(chuàng)面修復(fù)影響的因素較多，創(chuàng)面感染會(huì)累及皮膚組織，加快周圍組織感染。目前，改善上述癥狀主要是依靠皮膚殘留的上皮組織，形成皮島，提高融合速度[5]。目前，治療創(chuàng)面感染的目的在于避免感染和促進(jìn)上皮組織修復(fù)再生。目前，臨床對(duì)于本病的治療方法較多，外敷藥物貫穿整個(gè)用藥周期，能夠提高生理利用度，減少患者皮膚疼痛，加快創(chuàng)面愈合，已經(jīng)成為眾多學(xué)者研究重點(diǎn)[6-7]。

燒傷感染是燒傷疾病中一個(gè)重要發(fā)展階段，出現(xiàn)嚴(yán)重?zé)齻颊撸瑒?chuàng)面會(huì)有滲出液，外部環(huán)境有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖[8]。大量研究表明在燒傷患者創(chuàng)傷中檢測(cè)出銅綠假單胞菌檢出率較高。銅綠假單胞菌是傷口創(chuàng)面感染為主要臨床感染來源，感染后皮膚黏膜防御功能減退，更有利于細(xì)菌累及深層皮膚組織，出現(xiàn)免疫功能紊亂，加大對(duì)細(xì)菌的易感性，如不及時(shí)治療預(yù)后較差[9-10]。磺胺嘧啶鋅軟膏是臨床用于燙傷的外用藥物，其中主要成分為磺胺嘧啶及鋅，前者能夠?qū)Χ喾N病原菌具有抑制作用，后者能夠加快創(chuàng)面愈合作用。以往研究表明，對(duì)燙傷感染創(chuàng)面皮膚組織進(jìn)行鋅元素檢驗(yàn)，顯示創(chuàng)傷組織中鋅的含量低于周圍正常皮膚組織[11]。倪曉霞等[12]研究顯示，磺胺嘧啶鋅軟膏中成分鋅能夠加快皮膚纖維細(xì)胞的修復(fù)及再生，提高膠原合成，加快創(chuàng)面愈合。磺胺嘧啶鋅軟膏中磺胺嘧啶抗菌能力較強(qiáng)，與臨床用藥磺胺甲惡唑相似，屬于廣譜抑菌藥物，能夠有效抑制銅綠假單胞菌繁殖再生，能夠提高愈合率，不良反應(yīng)少。本研究結(jié)果顯示，采用磺胺嘧啶鋅軟膏能夠顯著減少銅綠假單胞菌數(shù)量，加快創(chuàng)面愈合，降低愈合時(shí)間，這與Dehkordi 等[13]研究結(jié)果相似，說明磺胺嘧啶鋅軟膏能夠治療燙傷感染小鼠，療效較好。

圖1 各組小鼠創(chuàng)面組織病理比較，×200。A：對(duì)照組；B：干預(yù)組。黑色箭頭表示肉芽組織，白色箭頭表示炎癥細(xì)胞.

圖2 各組小鼠創(chuàng)傷組織的CTGF 蛋白表達(dá)。A：對(duì)照組，B：干預(yù)組.

圖3 各組燙傷小鼠模型愈合的影響。A：對(duì)照組，B：干預(yù)組。A1、B1：1 d；A2、B2：7 d；A3、B3：14 d.

燙傷感染后皮膚組織出現(xiàn)大面積壞死，持續(xù)性的全身感染不可避免，機(jī)體出現(xiàn)炎癥浸潤后，中性粒細(xì)胞會(huì)活化從而釋放大量的活性氧等物質(zhì)，加快創(chuàng)面組織的持續(xù)損傷[14-15]。同時(shí)，巨噬細(xì)胞也會(huì)被激活，白細(xì)胞介素及腫瘤壞死因子等會(huì)釋放，加大炎癥反應(yīng)，加重燙傷感染的發(fā)生及發(fā)展，嚴(yán)重者導(dǎo)致其他疾病產(chǎn)生，危害患者生命安全[16]。磺胺嘧啶鋅軟膏刺激性較小，能夠增加創(chuàng)面血液循環(huán)，提高局部代謝水平，減少滲透，降低炎癥浸潤，有利于組織愈合和結(jié)痂形成，加快好轉(zhuǎn)[17]。本研究顯示，磺胺嘧啶鋅軟膏能夠降低小鼠血清中TNF-α、IL-10、IL-6水平，這與宋錫剛等[18]研究結(jié)果相似，說明磺胺嘧啶鋅軟膏能夠通過降低炎癥因子水平，加快血液循環(huán)，加快皮膚組織痊愈。

CTGF 是血小板生長(zhǎng)因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白，水平升高有利于提高皮膚組織再生。Guo 等[19]研究顯示，對(duì)燙傷感染小鼠組織提高CTGF 水平有利于加快創(chuàng)傷感染組織修復(fù)。研究表明，磺胺嘧啶鋅軟膏能夠提高組織中CTGF 水平，但是具體研究機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[20]。本研究結(jié)果表明，磺胺嘧啶鋅軟膏能夠提高CTGF 水平，加快組織愈合，這與Chen[21]研究結(jié)果相似，說明磺胺嘧啶鋅軟膏能夠通過提高CTGF 水平，增加燙傷感染組織痊愈能力，加快好轉(zhuǎn)。

綜上所述，磺胺嘧啶鋅軟膏能夠減少燙傷感染小鼠創(chuàng)傷銅綠假單胞菌數(shù)量，加快創(chuàng)面愈合，有利于減少組織炎癥，療效較好。