A549肺癌細胞條件培養(yǎng)液促進人骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和遷移*

姜 楊 王璐璐 金海峰 姚立杰 張 嵩 劉丹陽 李永濤 張善強 沈 雷△

（齊齊哈爾醫(yī)學院，1 解剖學教研室，2 細胞生物學教研室，3組織學胚胎學教研室，齊齊哈爾 161006）

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是促成肺癌發(fā)生的因素之一[1]。趨化因子濃度增高能夠誘使細胞歸巢[2]。趨化因子-8（C-X-C motif chemokine ligand-8，CXCL-8）除了促進MSC運動[3]，還在結(jié)腸癌、膀胱癌等腫瘤組織高表達[4-5]，并是預測宮頸癌發(fā)生的重要指示[6]，再次證實CXCL-8 對腫瘤細胞遷移具有關(guān)鍵作用。Akt 通路調(diào)節(jié)的肌動蛋白收縮導致細胞運動[7]，CXCL-8可活化血管內(nèi)皮細胞Akt-STAT3 通路[8]，促進血管新生[9]。CXCL8 為促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移提供了新血管形成、細胞運動等基礎條件[10]。雖然非小細胞肺癌高表達的CXCL-8 促進了肺癌發(fā)展[11]，但是肺癌細胞通過CXCL8 招募MSC 歸巢的作用和機制仍不清楚。本實驗在細胞水平觀察A549細胞表達的CXCL-8 通過Akt 通路對人骨髓間充質(zhì)干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）增殖或運動產(chǎn)生的影響，研究結(jié)果將為抑制肺癌提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

hBMSCs 購于武漢普諾賽生命科技有限公司。A549細胞和BEAS-2B 細胞均購于美國菌種保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。人CXCL-8 重組蛋白和triciribine（美國Selleck 公司）；DMEM/F12 培養(yǎng)基、α-MEM 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；RIPA 細胞裂解液、BCA 蛋白定量檢測試劑盒等試劑（上海碧云天生物科技公司）；人CXCL-8、Akt、P-Akt蛋白ELISA 試劑盒（美國Antibodies 公司）；MTT、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜（美國Sigma 公司）；Annexin V-PI 細胞凋亡試劑盒（美國Hyclone 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

A549細胞、BEAS-2B 細胞分別用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基或DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)hBMSCs。4.5×106個/mL A549細胞或BEAS-2B細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h，800 r/min 離心5 min，分別提取A549細胞和BEAS-2B細胞上清液，0.22 μm 濾器抽濾，液氮保存。正常條件下，無任何刺激的hBMSCs 為對照組。以體積比1∶4 稀釋A549細胞或BEAS-2B 細胞上清液為條件培養(yǎng)基[12]，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的hBMSCs 為A549組 或BEAS-2B組；3組均添加50 nmol/L CXCL-8則為A549 C組和BEAS-2B C組；若同時添加100 nmol/L triciribine則分別為A549 CT組 和BEAS-2B CT組。A549組加入100 nmol/L triciribine 則為A549 T組。

1.3 ELISA 檢測CXCL-8、Akt 或P-Akt蛋白含量

人ELISA試劑盒檢測A549細胞和BEAS-2B細胞上清液中CXCL-8蛋白含量。4℃，以RIPA細胞裂解緩沖液裂解密度為4.5×106個/mL各組hBMSCs，10 000 r/min離心5 min；BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測總蛋白濃度后，再以人ELISA試劑盒檢測各組hBMSCs中Akt或P-Akt蛋白的含量[8]。

1.4 Transwell 細胞遷移實驗檢測hBMSCs遷移數(shù)目

1.5×104個/mL hBMSCs置于Transwell細胞小室內(nèi)，下層腔室加入按實驗分組設置而添加的試劑或條件培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h，擦除transwell細胞小室內(nèi)hBMSCs，0.01 mmol/L PBS 清洗3次，每次1 min；4%多聚甲醛溶液固定transwell細胞小室60 min，0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次1 min；1%結(jié)晶紫染色30 min。Image-Pro Plus 6.0.1（IPP 6.0.1）軟件計算單位面積下被結(jié)晶紫染色的hBMSCs遷移數(shù)目。

1.5 MTT 檢測細胞增殖吸光度

0.6×104個/mL hBMSCs加入96孔細胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h；按照實驗分組分別加入各組條件培養(yǎng)基或試劑。37℃，5%CO2培養(yǎng)12 h；加入5 g/L MTT 溶液，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再添加二甲基亞砜，Emax Plus 酶標儀在490 nm 波長檢測細胞增殖吸光度（absorbance value，A490值）。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

用1.25% Annexin V-FITC溶液重懸2×105個/mL各組hBMSCs，孵育20 min；10 000 r/min離心5 min；0.01 mmol/L PBS清 洗3次，每次1 min；加 入2%PI溶液，冰上孵育2 min，10 000 r/min離心5 min，0.01 mmol/L PBS重懸。FACSAria Ⅱ型流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs 增殖

對照組、BEAS-2B組、A549組、BEAS-2B C組、A549 C組、A549 T組、A549 CT組 和BEAS-2B CT組的A490值分別為0.91±0.05、0.93±0.06、1.13±0.01、1.35±0.07、1.72±0.09、0.94±0.11、1.39±0.06、1.04±0.03，各組hBMSCs增殖的A490值差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。相對于BEAS-2B組和對照組，A549組A490值升高；A549 C組hBMSCs細胞A490值最高；A549 CT組比A549 C組A490值降低。這提示CXCL-8能夠促進hBMSCs增殖；A549細胞上清液含有促進hBMSCs增殖的活性成分。

2.2 hBMSCs 凋亡

對照組（43.1%）、BEAS-2B組（40.9%）、A549組（31.2%）、BEAS-2B C組（26.1%）、A549 C組（10.3%）、A549 CT組（13.4%）、BEAS-2B CT組（29.0%）、A549 T組（37.2%），各組細胞凋亡率相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖1）。A549組hBMSCs 凋亡率比BEAS-2B組和對照組顯著降低；A549 C組hBMSCs 凋亡率最低，添加了Akt抑制劑的各組hBMSCs 凋亡率比相應各組hBMSCs凋亡率均呈升高趨勢。結(jié)合細胞增殖實驗結(jié)果，共同提示A549細胞能夠促進hBMSCs 增殖，抑制hBMSCs 凋亡，說明A549細胞分泌的上清液中含有提高hBMSCs 活性的有效因子（圖1）。

圖1 流式細胞儀檢測各組hBMSCs 細胞凋亡

2.3 hBMSCs遷移

Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示（圖2），對照組、BEAS-2B組、A549組、BEAS-2B C組、A549 C組、A549 T組、A549 CT組 和BEAS-2B CT組 穿過transwell 細胞小室基膜的hBMSCs 數(shù)目分別為40.53±1.13、42.72±1.55、59.64±1.95、53.67±2.04、75.05±1.37、43.83±2.16、61.32±2.13、35.94±1.81，各組hBMSCs遷移數(shù)目差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。相對于BEAS-2B組和對照組，A549組hBMSCs遷移數(shù)目升高；A549 C組hBMSCs遷移數(shù)目最高；A549 CT組 比A549 C組遷移數(shù)目降低。提示CXCL-8 促進hBMSCs遷移的作用可被Akt 抑制劑所抑制。

圖2 Transwell 細胞遷移實驗檢測各組hBMSCs 的12 h 細胞遷移，標尺=100 μm

2.4 A549細胞和BEAS-2B細胞上清液中CXCL-8蛋白的含量

ELISA 驗證A549細胞上清液中含有的活性因子顯示，A549上清液中CXCL-8含量是（13.108±0.120）ng/L，BEAS-2B上清液CXCL-8含量為（6.053±0.340）ng/L，2組數(shù)據(jù)相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.5 hBMSCs 的Akt、P-Akt蛋白含量情況

ELISA結(jié)果顯示各組hBMSCs的Akt和P-Akt蛋白含量分別為：對照組（7.54±1.04）mg/L和（6.93±1.13）mg/L ；BEAS-2B組（7.60±1.69）mg/L和（6.82±1.07）mg/L；A549組（14.27±1.53）mg/L 和（11.92±1.18）mg/L ；BEAS-2B C組（19.03±1.45）mg/L和（16.69±1.02）mg/L；A549 C組（31.52±1.78）mg/L和（29.08±1.93）mg/L；A549 T組（26.31±1.59）mg/L 和（18.42±1.63）mg/L ；A549 CT組（13.23±1.31）mg/L 和（12.90±1.77）mg/L和BEAS-2B CT組（9.24±1.55）mg/L和（6.22±1.43）mg/L。各組hBMSCs的Akt蛋白含量差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），P-Akt蛋白含量差異也具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。相對于BEAS-2B組和對照組，A549組Akt 和P-Akt蛋白含量明顯升高；A549 C組Akt和P-Akt蛋白含量明顯最高；添加了Akt 抑制劑的各組細胞Akt 和P-Akt蛋白含量比相應各組呈降低趨勢。以上結(jié)果證明：A549細胞上清液含有的CXCL-8 通過激活hBMSCs 內(nèi)Akt信號通路，促進hBMSCs 增殖和運動。

3 討論

3.1 A549細胞表達CXCL-8提高hBMSCs增殖或遷移能力

轉(zhuǎn)移性癌細胞通常不能用傳統(tǒng)的外科或放化療策略根除，治療后疾病復發(fā)極為常見，清除腫瘤干細胞是抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[13]。干細胞治療方法在癌癥治療中顯示出越來越大的希望。干細胞通過歸巢能到達原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤病灶，并以載體的形式穩(wěn)定表達靶向抗腫瘤藥物，可減小腫瘤體積，延長存活時間，減輕治療副作用[14]。闡明MSC等干細胞歸巢到惡性腫瘤微環(huán)境的機制，提高MSC歸巢率是開展MSC在惡性腫瘤治療的前提。

MSC 廣泛分布在骨髓、脂肪、臍帶血等多種組織，容易分離和體外培養(yǎng)。MSC 可多向分化為骨、軟骨、脂肪、血管等組織，還能分泌SDF-1α、VEGF、EGF 等大量趨化因子、生長因子等生物活性分子，對維持MSC 干性起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[15]。研究表明，與腫瘤細胞活性相類似，MSC也具有易遷移、向組織歸巢運動能力[16]。肺癌細胞與MSC 相互影響，相互促進，MSC 在肺癌等惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中扮演關(guān)鍵作用[17]。目前發(fā)現(xiàn)MSC 具有定向遷移到腫瘤組織，促進腫瘤轉(zhuǎn)移的能力，與胃癌、乳腺癌等多種癌癥進展有關(guān)，表現(xiàn)出較好地維持腫瘤生長的能力[18]。但是從趨化因子角度闡明肺癌組織招募MSC 的機制還不清楚。

本實驗采取A549 為研究對象，觀察A549 肺癌細胞上清液對hBMSCs 增殖、凋亡和遷移作用效果和機制。相關(guān)實驗結(jié)果提示A549細胞上清液中可能具有活化hBMSCs 的活性物質(zhì)。袁哲等[19]將A549細胞條件培養(yǎng)基按照體積濃度分為高濃度（100%）和低濃度（50%）2組，使用MTT 和transwell 細胞遷移實驗分別觀察對人臍帶血MSC增殖和遷移的影響，顯示低或高濃度A549 條件培養(yǎng)基均明顯促進人臍帶血MSC 增殖和遷移率，尤以高濃度組實驗結(jié)果為甚。本實驗研究結(jié)果與該研究相符。但是袁哲等[19]并未對A549細胞條件培養(yǎng)基對人臍帶血MSC 凋亡效果或招募人臍帶血MSC歸巢的機制進行分析。本研究深入開展了Annexin V-PI 細胞凋亡實驗，觀察到A549細胞上清液還可以降低hBMSCs 的細胞凋亡率，推測A549 上清液中可能含有某些激活hBMSCs 的活性因子。

張鵬等[20]報道CXCL-8 對人脂肪間充質(zhì)干細胞具有較好的促進運動能力。趨化因子對多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展具有較好調(diào)控能力。食管癌表達的CXCL-8（又稱IL-8）通過激活STAT3信號通路，抑制NK 細胞定向趨化到癌組織，進而促進食管癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)[21]。本研究采用ELISA 實驗顯示A549上清液中CXCL-8表達明顯升高，與CXCL-8 在惡性腫瘤組織較高表達的結(jié)果相一致[21]。為了進一步驗證CXCL-8在A549細胞對hBMSCs的影響，實驗又設立了陽性對照組，即向BEAS-2B組或A549組添加了CXCL-8重組蛋白。結(jié)果顯示，BEAS-2B C組hBMSCs增殖或遷移率明顯比BEAS-2B組升高，A549 C組的增殖或遷移率呈現(xiàn)最高，進一步說明CXCL-8在A549細胞條件培養(yǎng)基誘導hBMSCs增殖和遷移能力方面發(fā)揮了重要作用。

胰腺癌、胃癌等腫瘤表達CXCL-8 會促進血管新生[22-23]。CXCL-8除了對MSC等細胞具有較強招募作用外[8，20]，還能夠促進MSC分泌VEGF，促使血管內(nèi)皮細胞黏附，加速血管新生等作用[8，22-23]。本實驗只檢測了CXCL-8一種趨化因子含量，A549細胞分泌的上清液可能還含有其他炎癥因子或趨化因子，這些活性成分的檢測還需要借助高效液相色譜技術(shù)或基因芯片等手段進一步驗證。

3.2 A549細胞表達CXCL-8激活hBMSCs內(nèi)Akt信號通路

添加triciribine 的A549 CT組hBMSCs增殖和細胞遷移率降低，細胞凋亡率升高，更說明A549細胞上清液通過Akt信號通路發(fā)揮作用。A549組hBMSCs 的Akt 和P-Akt蛋白表達均明顯增加；A549 CT組hBMSCs 的Akt 和P-Akt蛋白表達均明顯降低。這說明A549細胞上清液中的CXCL-8與hBMSCs 表面的CXCR1/2 受體結(jié)合[24]，能夠激活hBMSCs 內(nèi)Akt信號通路。結(jié)合使用Akt 抑制劑的A549 CT組實驗結(jié)果，再次證明A549 能夠表達CXCL-8 趨化因子，通過Akt信號通路發(fā)揮了招募MSC 歸巢的作用。如果阻斷Akt信號通路或其下游的mTOR等相關(guān)蛋白，CXCL-8會降低MSC歸巢效率，更說明CXCL-8 通過PI3K-Akt-mTOR信號通路使更多的MSC歸巢。

綜上所述，A549細胞微環(huán)境表達的CXCL-8激活hBMSCs 內(nèi)Akt信號通路，促進hBMSCs 增殖或遷移，對闡明腫瘤微環(huán)境與MSC相互作用，揭示肺癌干細胞來源，尋找抑制肺癌發(fā)生發(fā)展的方法具有非常重要的意義。