慢性間斷性缺氧對雄仔鼠肝胰島素樣生長因子-1基因組蛋白修飾的作用*

黃 煌 林逕蒼 呂國榮 許險艷 許相洋

（泉州醫學高等專科學校組織學胚胎學教研室，泉州 362000）

Barker 等[1-2]在20 世紀90年代指出，成年時期的某些疾病有可能來源于“胚胎”，例如胎兒時期氧氣、營養等環境因素會影響胚胎早期發育，導致成年期的某些代謝性疾病會被程序性控制[3-5]。胰島素樣生長因子-l（insulin-like growth factor-l，IGF-1）主要在肝產生，游離的IGF-1 可以結合相應的受體，促進脂肪的合成，且抑制其分解，使游離脂肪酸溶度降低。另外IGF-1 有促進物質代謝、降低血糖、促進生長發育等生理功能。非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）鏡下主要病理特征是彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性，其特征與酒精性脂肪性肝病（alcoholic fatty liver disease，AFLD）相似，但NAFLD一般無過量飲酒史。課題組前期研究表明，NAFLD發生發展的程度與IGF-l的表達水平呈負相關[6-7]，NAFLD仔鼠用高脂飲食飼養顯示其肝細胞IGF-1 mRNA水平明顯比正常仔鼠低[8-9]。本研究建立孕大鼠缺氧模型，觀察慢性間斷性缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）對子代1 d齡雄仔鼠肝細胞作用及IGF-1基因組蛋白修飾和表達情況。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康SD大鼠24只，懷孕齡7d，體質量175～195 g，購自上海斯萊克公司[許可證：SCXK（滬）2007000569092]。辣根酶標記兔抗羊IgG、SP兩步法試劑盒、real-time PCR試劑、免疫蛋白印跡試劑、染色質免疫共沉淀技術（chromatin immunoprecipitation，ChIP）試劑等購自福州鼎鑫泰斯特科技有限公司；兔抗大鼠IGF-1抗體、HRP標記羊抗兔IgG二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 CIH 模型制備及動物分組

SD 孕大鼠24 只隨機分為對照組和缺氧組，每組12只。對照組于40%～70%相對濕度，溫度18℃～25℃塑料籠（帶不銹鋼蓋）內飼養，自由攝水，自然采光；缺氧組置入缺氧箱飼養，及時調整O2、N2流量，用小風扇將箱內的空氣不斷地混勻，將O2濃度控制在10.0%±0.5%（對照組O2濃度為21%）。缺氧箱內、外借箱壁的小孔溝通，箱內氣壓與大氣壓平衡。每天8 h 維持這種狀態，即上 午6：30—10：30、下 午15：30—19：30。重復至妊娠第21 天。待產孕鼠分籠，每只孕鼠分娩仔鼠12～13 只，分娩得到12 窩對照組仔代大鼠156 只，12 窩缺氧組仔代大鼠153只。2組孕鼠平均產仔數及胎鼠存活率、雌雄比例差異均無統計學意義。因雌激素可干擾機體脂質代謝水平[10]，故本研究采用日齡1 d 的雄仔鼠。

分娩后，隨機選取對照組、缺氧組各30只日齡1 d 的雄仔鼠，麻醉處死后取肝組織標本，分別做ChIP 檢測、real-time PCR、免疫蛋白印跡、電鏡檢查、免疫組織化學檢查，每項標本各6只。

1.3 免疫組織化學檢測肝組織IGF-1表達

常規石蠟標本制片，采用免疫組織化學顯色檢測肝組織IGF-1 蛋白表達，按試劑盒說明書操作。一抗及二抗工作濃度均為1：100。以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達，運用Image-Pro Plus 6.0型圖像處理分析軟件，測定切片平均光密度值（average optical density，AOD）。

1.4 電子顯微鏡觀察肝組織超微結構

取2組1 d 齡的雄仔鼠肝組織，置于3%戊二醛中，放于4℃2 h 以上，用0.1 mol/L PBS（pH=7.2）漂洗，共3次；標本置于1%鋨酸，4℃1.5 h，用0.1 mol/L PBS（pH=7.2）漂洗3次，乙醇脫水；經過浸透、包埋和聚合后，用超薄切片機切片，染色后水洗，電鏡下觀察肝組織超微結構。

1.5 Real-time PCR 檢測肝組織 IGF-1 mRNA 水平

提取1 d 齡雄仔鼠肝組織，使用TRIzol 法抽提肝組織總RNA，將RNA 逆轉錄成cDNA，再行定量PCR 反應。根據 Genebank 的數據庫（Primer 5.0）設計引物序列。IGF-1基因上游引物序列為5'-TTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTT-3'，下游引物序列為 5'-CTTCTCCTTTCTCTGTGTTG -3'；內參β-actin 上游引物序列為5'-GGCTCTCTGCTCCTC C-3'，下游引物序列為5'-CCGTTCACACCGACT T-3'。Real-time PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性 30 s，54℃退火30 s，68℃延伸30 s，共 30個循環；68℃延伸 10 min；95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。采用公式2-ΔΔCT計算mRNA表達量。

1.6 免疫蛋白印跡檢測IGF-1 蛋白表達水平

取2組1 d齡雄仔鼠肝組織標本，依照 RIPA說明書進行免疫蛋白印跡檢測。其主要的步驟為：肝組織總蛋白提取、蛋白質變性樣品與加樣、分離膠和濃縮膠的配置、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳灌膠和上樣、電泳、轉膜、封閉、免疫反應、ECL 反應及膠片曝光、凝膠圖像分析。掃描獲取條帶的灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比作為蛋白相對表達量。

1.7 ChIP 檢測IGF-1組蛋白

ChIP 為可以快速反映蛋白質-DNA 相互作用的表觀遺傳學的技術。其主要步驟為：穩定蛋白質-DNA 復合物、分離核組分；超聲處理使染色質片段化（長度200～1 000 bp）；使用目的蛋白特異性抗體（表1）捕獲蛋白質-DNA 復合物中的目標蛋白質，抗體免疫沉淀，并從細胞核組分中分離蛋白質；解交聯并且純化 DNA，以染色質免疫沉淀所得DNA 為模板，使用IGF-1基因各位點引物用real-time PCR 法定量各組蛋白修飾的水平。選擇GAPDH 序列為內參照。經檢測該序列含有所有5 種共價修飾引物序列（表2）。

1.8 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。呈正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 組蛋白修飾抗體

2 結果

2.1 妊娠期缺氧動物模型的建立

缺氧組孕鼠的動脈血氧分壓、氧濃度和對照組孕鼠比較明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。但缺氧組孕鼠和對照組孕鼠血液中CO2分壓及pH值差異無統計學意義（P＞0.05）（表3），提示CIH模型建立成功。缺氧組孕鼠母體受缺氧應激，僅出現低氧血癥。

表2 共價修飾引物序列

表3 孕鼠動脈血氣分析比較（n=12，±s）

表3 孕鼠動脈血氣分析比較（n=12，±s）

*P＜0.05 vs 對照組

組別 血氧分壓（kPa）氧濃度（%）二氧化碳分壓（kPa）pH值對照組 11.29±2.68 92.6±8.1 6.22±1.25 7.4±1.1缺氧組 7.14±2.75* 75.3±3.4* 5.90±2.17 7.3±2.5

2.2 子代1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1 的表達

免疫組織化學檢測結果顯示，對照組1 d 齡雄仔鼠的肝IGF-1表達水平（3.66±0.71）高于缺氧組（1.83±0.51），IGF-1 主要表達在細胞質（圖1）（P＜0.05）。

圖1 對照組（A）及 缺氧組（B）1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1 的表達，免疫組織化學顯色，×100

2.3 子代1 d 齡雄仔鼠肝的超微結構

電鏡下形態學顯示，對照組肝超微結構無明顯異常（圖2A），缺氧組肝超微結構基本正常，偶爾在細胞質中出現脂肪滴（圖2B）。

2.4 子代1d 雄仔鼠肝組織IGF-1 mRNA 及蛋白表達水平

Real-time PCR結果表明，對照組IGF-1 mRNA水平（0.928 873±0.012 445）高于缺氧組（0.503 444±0.010 900），差異有統計學意義（P＜0.05）。

對照組IGF-1 蛋白（1.878 47±0.038 63）表達水平顯著高于缺氧組（0.903 23±0.038 32），差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.5 IGF-1基因組蛋白ChIP 測序

2.5.1 Proximal 3'UTR基因 ChIP測序結果顯示（圖4），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因Proximal 3'UTR片段H3K9me3、H3K4me3、H3k14ac、H3K36me3、H3K4me2組蛋白的修飾，差異無統計學意義（P＞0.05），但H3K9ac組蛋白修飾差異有統計學意義（P＜0.05），表明缺氧組肝組織IGF-1基因Proximal 3'UTR 片段組蛋白H3K9ac 乙酰化程度較對照組顯著降低（圖4）。

圖2 對照組（A）及缺氧組（B）子代1 d 齡雄仔鼠肝形態結構比較，透射電鏡，×4 000

圖3 免疫蛋白印跡檢測子代1 d 齡雄仔鼠肝組織中IGF-1 的表達（n=3）

圖4 1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1基因Proximal 3'UTR 片段組蛋白修飾對比圖

2.5.2 P1基因 ChIP測序結果顯示（圖5），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因P1片段的組蛋白H3K14ac、H3K9ac、H3K4me2、H3K36me3、H3K9me3、H3K4me3修飾差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5.3 P2基因 ChIP測序結果顯示（圖6），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因P2片段組蛋白H3K14ac、H3K9ac、H3K4me2、H3K36me3、H3K9me3、H3K4me3修飾差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖5 1 d 齡雄仔鼠肝組織IGF-1基因P1 片段組蛋白修飾對比圖

圖6 1 d 齡雄仔鼠肝組織IGF-1基因P2 片段組蛋白修飾對比圖

2.5.4 Exon 5基因 ChIP測序結果顯示（圖7），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因Exon 5片段的H3K36me3、H3K14ac、H3K4me3、H3K4me2、H3K9me3組蛋白修飾差異無統計學意義（P＞ 0.05），但H3K9avs位點組蛋白修飾差異有統計學意義（P＜0.05），表明缺氧組肝IGF-1基因Exon 5片段組蛋白H3K9ac乙酰化程度較對照組顯著降低。

2.5.5 Distal 3'UTR基因 ChIP測序結果顯示（圖8），對照組和缺氧組肝組織IGF-1基因Distal 3'UTR片段 的H3K9me3、H3K36me3、H3K4me3、H3K4me2、H3K14ac組蛋白修飾差異無統計學意義（P＞0.05），但H3K9ac組蛋白修飾差異有統計學意義（P＜0.05），提示缺氧組肝IGF-1基因Distal 3'UTR片段組蛋白H3K9ac 乙酰化程度較對照組顯著降低。

圖7 1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1基因Exon 5 片段組蛋白修飾對比圖

圖8 1 d 齡雄仔鼠肝IGF-1基因Distal 3'UTR 片段組蛋白修飾對比圖

3 討論

產前的缺氧是臨床最重要、最相關的刺激，很多病理狀況與宮內缺氧關系密切，如母體貧血、吸煙、胎盤功能不全、哮喘、先兆子癇等[11-12]。目前有一些學者使用動物模型進行相關的實驗研究，如孕期宮內慢性缺氧等動物模型[13]。課題組前期根據母體慢性宮內缺氧和子代成年疾病有關的假說進行相關研究，取得一些研究結果[14-17]。本研究進一步采用已經成熟的動物模型[18-20]，研究CIH 對子代大鼠肝發育及IGF-1表達的影響。CIH 模型缺氧組孕鼠采用的氧濃度為10.0%±0.5%，范圍和臨床實踐中先兆子癇、妊高癥等常導致胎兒缺氧的氧濃度相互吻合，可模擬臨床實踐中的胎兒缺氧狀況。結果顯示，缺氧組的孕鼠沒有出現CO2潴留、酸中毒，僅有低氧血癥現象，缺氧組孕鼠僅受缺氧因素作用，說明造模成功。

課題組用 SD大鼠制作CIH動物模型，觀察持續到仔鼠的成年期（5月齡），妊娠期缺氧也顯著升高缺氧組雄性仔鼠甘油三酯、血清胰島素、低密度脂蛋白膽固醇、胰島素抵抗指數，游離脂肪酸等，與前期實驗結果一致，出現大鼠機體胰島素抵抗[18-20]。前期研究結果顯示，CIH可引起胎鼠生長緩慢，伴隨主要器官的生長不成比例，低出生體質量仔鼠。但缺氧組出生后出現趕超性生長，生后 20 d左右，缺氧組仔鼠體質量追趕上對照組，出現出生后缺氧組追趕性生長的現象，此現象可能是缺氧組仔鼠成年期的肝脂質大量快速沉積的原因之一[14-20]。

IGF-l 是受到表觀遺傳調控的可以介導調節胚胎生長發育的基因，人類IGF-1基因結構和大鼠有很高的相似度。有學者研究顯示，宮內不良的環境可導致大鼠肝IGF-1 表觀遺傳學表現發生改變[21-22]。表觀遺傳學指在核苷酸序列沒有發生改變時，研究基因表達的可遺傳變化。對于環境變化，表型已經發生改變，但基因型沒有改變，在細胞分裂過程中能保持相對穩定，并且可以隨機發生。表觀遺傳現象已知有組蛋白共價修飾、DNA 甲基化等。染色質的最基本結構單位是核小體，其核心由H2A、H2B、H3 和H4組蛋白組成為八聚體，147 bp 的DNA 纏繞于八聚體外周。氨基末端（N端）在八聚體核心外周延伸出來，翻譯后可以產生共價修飾。最重要的修飾方式有乙酰化、甲基化等，這些共價修飾可以影響染色質的構象、基因表達。組蛋白去乙酰基酶及組蛋白乙酰基轉移酶可以催化組蛋白乙酰化。通常情況下，核小體組蛋白高乙酰化狀態，為轉錄活躍區；低乙酰化為不轉錄活躍區[23-25]。

本研究采用ChIP 技術檢測對照組和缺氧組肝IGF-1基因的組蛋白修飾，其中對于Exon 5、Proxima1 3'UTR、Distal 3'UTR、Pl、P2 片段的位點H3K9me3、H3K4me3、H3K14ac、H3K36me3、H3K4me2、H3K9ac 的組蛋白修飾進行檢測。結果提示，慢性宮內缺氧導致了缺氧組肝組織IGF-1基因的Proximal 3'UTR、Exon 5、Distal 3'UTR 片段的H3K9ac組蛋白乙酰化共價修飾的水平顯著降低，IGF-1 mRNA轉錄水平下降，IGF-1 蛋白表達水平降低。且缺氧組肝可見少量脂肪滴，提示有脂肪代謝障礙，推測發生NAFLD。

綜上所述，CIH 可致缺氧組肝IGF-1基因表觀遺傳機制改變，可能參與宮內缺氧后雄性仔鼠非酒精性脂肪肝的發生發展過程。