星點設計-響應面法優化番茄紅素納米結構脂質載體的制備

馬永強，修偉業，黎晨晨，王藝錡，陳俊杰

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

番茄紅素是一種具有功能性的類胡蘿卜素，是由規則的頭尾結合連接8 個異戊二烯單元組成的四萜化合物[1]，具有抗氧化[2]、保護心血管系統[3]、降血糖[4]等功能。人體和動物體內番茄紅素不能自身合成，均需從通過食物攝取。番茄紅素廣泛存在于西紅柿、胡蘿卜、番石榴、葡萄柚、番木瓜等果蔬中，食品中的番茄紅素主要以全反式的形式存在[1]。由于番茄紅素在人體中吸收利用率較低[5]，在食品工業應用上存在困難。隨著科學技術的發展，已出現異構化[6]、包埋[7-8]等技術用以提高番茄紅素穩定性并提高其生物利用率。

納米脂質載體系統是將脂質等作為壁材，包埋生物活性物質，采用納米脂質載體系統處理的生物活性物質具有更高的生物學功能活性。納米結構脂質載體（nanostructured lipid carrier，NLC）被稱為第二代納米脂質載體系統[9]，其壁材脂質是將其中一部分固體脂質由液體脂質或液體脂質混合物代替，以輸送難溶的生物活性物質，提高穩定性及活性物質的生物利用率。納米結構脂質載體制備方式主要有乳液-溶劑蒸發法[10]、超臨界CO2法[11]、高剪切均質法[12]、薄膜蒸發法[13]、超聲法[14]、乙醇注入法[15]等方法。乙醇注入法是將無水乙醇溶解的含活性物質有機相溶液通過注射器注入水相，形成納米結構脂質載體的方法，其創新點在于有機試劑應用少，且實驗中不引入有毒化學試劑。此外，此法適用于熱穩定性較差的活性物質，具有熱敏性藥物適應性較強等特點，與探頭式超聲法聯合后可減小納米結構脂質載體粒徑并使粒徑分布均一。

采用乙醇注入-探頭式超聲法聯合制備番茄紅素納米結構脂質載體（lycopene-NLC，Lyco-NLC），以提高番茄紅素的穩定性及利用率。實驗以Lyco-NLC包封率及粒徑為指標，通過單因素試驗及星點設計-響應面法優化番茄紅素納米結構脂質載體制備工藝，并對采用優化條件制備的Lyco-NLC進行表征，為番茄紅素系列功能產品開發提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄紅素為市售。

番茄紅素標準品 上海保藏生物技術中心；大豆卵磷脂 廣州海莎生物科技有限公司；膽固醇 北京博奧拓達科技有限公司；中鏈甘油三酯（medium chain triglyceride，MCT） 廣東永晟工貿有限公司；正己烷、無水乙醇（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；Tween 20、Tween-80 廣東潤華化工有限公司。

1.2 儀器與設備

FA1104B電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司；HWS-25電熱恒溫水浴鍋 上海一博科學儀器有限公司；EMS 18A磁力攪拌器 上海隆拓儀器設備有限公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；TG16-WS臺式離心機 湖南湘儀儀器有限公司；UV-5200紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；Nano-ZS90激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Lyco-NLC的制備

準確稱取10 mg番茄紅素和一定量的大豆卵磷脂、MCT、膽固醇、Tween 20、Tween-80，充分溶于20 mL無水乙醇中，將混合溶液注入100 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L），不斷攪拌至乙醇完全揮發（即無明顯乙醇氣味）后50 ℃水化保溫一段時間（即水化時間），通過超聲波細胞粉碎機將水化后溶液探頭超聲處理，過0.45 μm微孔濾膜，4 ℃靜置過夜，得Lyco-NLC混懸液。

1.3.2 單因素試驗

選取液體脂質大豆卵磷脂、MCT（1∶1，m/m）為復合液體脂質，Tween 20、Tween-80（1∶1，m/m）為復合乳化劑，調整水化時間（15、30、45、60、75 min）、超聲時間（0、3、6、9、12 min）、超聲功率（98、163、228、293、358 W）、番茄紅素與復合液體脂質比（即藥脂比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，m/m）、膽固醇與復合液體脂質比（即固液脂質比1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，m/m）、磷酸鹽緩沖液pH值（6.2、6.5、6.8、7.1、7.4）的條件下進行單因素試驗，各因素固定時的取值為：水化時間45 min、超聲時間6 min、超聲功率228 W、藥脂比1∶40、固液脂質比1∶6、磷酸鹽緩沖液pH 6.8，考察其對番茄紅素納米脂質載體包封率及粒徑（即平均粒徑，下同）的影響。

1.3.3 星點設計-響應面優化試驗

根據單因素試驗和正交試驗（未列出）結果，選取水化時間（A）、超聲功率（B）和超聲時間（C）為自變量，以番茄紅素納米脂質載體包封率（Y）為因變量，采用星點設計-響應面法優化設計試驗，因素及水平編碼如表1所示。

表1 星點設計因素與水平Table 1 Factors and levels used for central composite design

1.3.4 包封率及載藥量測定

番茄紅素標準曲線的繪制：精密稱取10 mg番茄紅素標準品，溶解于正己烷并定容至100 mL，得番茄紅素標準儲備液，準確移取一定量番茄紅素標準儲備液分別制備質量濃度為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 μg/mL番茄紅素標準溶液，于474 nm波長處測定吸光度，以番茄紅素質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，平行測定3 次，繪制標準曲線。得到線性回歸方程：y＝0.296 4x-0.058 7，R2＝0.995 1。

包封率及載藥量的測定參考Zardini等[16]的方法，采用離心-萃取法測定Lyco-NLC包封率并做適當優化，將適量正己烷加入Lyco-NLC中，2 500 r/min離心4 min，離心3 次，取上層含游離番茄紅素的正己烷溶液于474 nm波長處測定吸光度，并根據標準曲線計算游離的番茄紅素質量m游，按公式（1）、（2）分別計算包封率及載藥量。

式中：m總為制備Lyco-NLC時加入番茄紅素總質量/g；m游為制備Lyco-NLC后游離的番茄紅素質量/g；m脂質為制備Lyco-NLC時添加的所有脂質（包括復合液體脂質和固體脂質膽固醇）總質量/g。

1.3.5 驗證實驗和穩定性實驗

根據Design-Expert 10.0.4軟件分析Lyco-NLC制備的最佳工藝條件，并在最佳工藝條件下制備Lyco-NLC，測定其包封率、粒徑、多分散指數及Zeta-電位；將Lyco-NLC于4 ℃條件下分別貯存1、3、7、15、30 d，測定其包封率、粒徑、多分散指數及Zeta-電位。

1.3.6 粒徑、多分散指數及Zeta-電位的測定

將稀釋后的Lyco-NLC樣品于25 ℃條件下，采用Nano-ZS90型激光粒度儀測定粒徑、多分散指數及Zeta-電位。

1.4 數據處理與分析

所有實驗進行3 次平行處理，采用SPSS 22.0軟件對數據進行處理，結果以平均值±標準差表示，采用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 水化時間對番茄紅素納米結構脂質載體的影響

圖1 不同水化時間對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響Fig.1 Effect of hydration time on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

水化時間對Lyco-NLC包封率及粒徑的影響實驗結果如圖1所示，隨樣品水化時間延長，Lyco-NLC包封率呈增加的趨勢。水化時間對Lyco-NLC粒徑變化影響明顯，15～30 min時粒徑隨水化時間的延長而減小，30 min達到最低值后粒徑增加，可能的原因是：在水化過程中，適當的水化時間有助于壁材閉合形成含番茄紅素的納米結構脂質載體囊泡，超過最適水化時間后壁材可能氧化或因黏度較大而聚積粒徑增加。此結果同聶華等[17]采用乙醇注入法制備靶向載紫杉醇脂質體結果類似。選擇水化時間45～75 min進行響應面優化。

2.1.2 超聲時間對番茄紅素納米結構脂質載體的影響

圖2 不同超聲時間對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

超聲時間對Lyco-NLC包封率及粒徑的影響結果如圖2所示，經超聲處理后，番茄紅素納米脂質載體顆粒粒徑明顯減小，原因是超聲的振蕩作用使粒徑降低，同時隨超聲處理時間的延長，納米脂質載體的包封率在9 min前呈現增加的趨勢，9 min時達到最大值，超過9 min后包封率下降。可能的原因是當超聲時間過長，脂膜被破壞，部分納米脂質載體顆粒破裂，包裹在其中的番茄紅素滲漏，包封率降低。王詩琪等[18]在采用逆向蒸發法方法制備蓮藕多酚與多糖復合脂質體及熊偉等[19]采用薄膜超聲法制備二氫楊梅素脂質體時，同樣得出隨超聲時間延長，脂質體包封率呈現先增加后下降的趨勢。選擇超聲時間6～12 min進行響應面優化。

2.1.3 超聲功率對番茄紅素納米結構脂質載體的影響

圖3 不同超聲功率對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

不同超聲功率對Lyco-NLC包封率及粒徑的影響實驗結果如圖3所示，隨超聲功率的增加，納米脂質載體的包封率在228 W前呈增加的趨勢，在228 W時達到最大值，之后包封率下降。納米脂質載體的粒徑隨超聲功率的增加先降低后增加，可能的原因是適當的超聲功率由于其振動作用可促進芯材包封，同時其產生的剪切力可適當降低納米脂質載體顆粒的粒徑；但超聲功率過大時，納米脂質載體結構破壞，芯材泄漏，包封率降低；同時顆粒相互黏附聚集，導致粒徑變大。呂方方等[20]在制備以羧甲基殼聚糖為壁材、椰油為芯材的脂質體時，通過實驗證明適當超聲功率可使脂質體包封率增加。選擇超聲功率228～358 W進行響應面優化。

2.1.4 藥脂比對番茄紅素納米結構脂質載體的影響

圖4 不同藥脂比對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響Fig.4 Effects of drug-to-lipid ratio on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

藥脂比對Lyco-NLC包封率及粒徑的影響結果如圖4所示，隨脂質添加量的增加，粒徑逐漸減小，而包封率呈先增加后降低的趨勢，在藥脂比為1∶40時包封率達到最大，可能的原因隨著脂質含量的增加，芯材被包裹的強度增大，導致包封率增加；但脂質過多無法形成適宜剛性的Lyco-NLC，芯材藥物滲漏現象逐漸明顯，導致在脂質含量進一步增加時包封率降低[21]。選擇最佳藥脂比為1∶36（正交試驗得出），寧雙成等[22]在制備斑蝥素納米結構脂質載體時得到隨著體系脂質含量增加，納米結構脂質載體包封率呈先增加后降低的結果。

2.1.5 固液脂質比對番茄紅素納米結構脂質載體的影響

圖5 不同固液脂質比對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響Fig.5 Effect of solid-to-liquid lipid ratio on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

不同固液脂質比對Lyco-NLC包封率及粒徑的影響實驗結果如圖5所示，隨液體脂質添加量的增加，包封率先增加后降低，原因是當液體脂質比較少時，納米結構脂質載體剛性較強，不能起到良好包封芯材藥物的作用，隨著液體脂質添加量增加，顆粒剛性減小，黏度增加，包封芯材藥物能力提升，包封率呈上升趨勢，但過量的液體脂質導致粒徑剛性不足以支撐粒徑結構，壁材破裂芯材滲漏，包封率降低。粒徑在固液脂質比為1∶2～1∶8時維持穩定，在固液脂質比為1∶10時增加至196.7 nm，可見液體脂質黏度增加，顆粒相互附著聚集，使粒徑增加。故選擇最佳固液脂質比為1∶6。閆丹等[23]制備積雪草總苷脂質體時，隨著卵磷脂與膽固醇質量比的增加，積雪草苷與羥基積雪草苷的包封率先增大后減小。

2.1.6 pH值對番茄紅素納米結構脂質載體的影響

圖6 不同pH值對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響Fig.6 Effect of pH on the encapsulation efficiency and particle size of Lyco-NLC

磷酸鹽緩沖液pH值對Lyco-NLC包封率及粒徑的影響結果如圖6所示，pH值在6.2～6.8區間包封率逐漸增加，在pH 6.8時達到峰值，之后包封率降低，粒徑在pH值為6.2～7.1區間逐漸降低，在pH 7.1時達到粒徑最低值后再增加，故選擇磷酸鹽緩沖液最佳pH值為6.8。潘翠珊等[24]在優化人參皂苷Rg3脂質體處方時得到相似的結果。

2.2 星點設計-響應面法試驗結果

表2 星點設計-響應面法試驗結果Table 2 Central composite design with experimental results

根據單因素試驗和正交試驗結果，得到最佳藥脂比1∶36、固液脂質比1∶6、磷酸鹽緩沖液pH 6.8，再選取水化時間、超聲功率、超聲時間三因素進行星點設計-響應面法設計，結果見表2，對表2中數據進行多元二次回歸擬合，得回歸方程：Y＝-324.72+2.33A+1.28B+34.79C-0.001AB+8.72AC-0.054BC-0.018A2-0.001B2-1.07C2。

表3 回歸方程的方差分析結果Table 3 Analysis of variance of regression model

采用單因素方差分析進行顯著性檢驗及方差分析，由表3可知，通過方差分析及顯著性分析，B、BC、A2、B2、C2項對實驗結果影響極顯著（P＜0.01），C項P值為0.038 6（0.01＜P＜0.05），對實驗結果影響顯著，模型對實驗結果影響極顯著（P＜0.01），失擬項P值為0.673 1，對實驗影響不顯著（P＞0.01），說明該模型對實驗實測值擬合效果好，模型的決定系數R2值為0.966 5，為增加模型預測的可靠性，適當修正后的R2Adj值為0.936 3，證明響應值的總變量僅有6.37%不能用此模型表示[25-26]，證明該模型可用于擬合實驗自變量與響應值之間的關系。

圖7 兩因素交互作用對包封率影響的等高線與曲面圖Fig.7 Contour and response surface plots showing the interactive effect of variables on encapsulation efficiency

為更直觀考察水化時間、超聲功率、超聲時間交互作用對Lyco-NLC包封率的影響，分析任意兩因素交互作用對Lyco-NLC包封率的影響。如圖7所示，水化時間、超聲功率、超聲時間任意兩因素交互時，隨因素水平逐漸增加Lyco-NLC包封率均呈現先增加后減少的趨勢，當超聲功率與超聲時間交互時，等高線呈橢圓形，響應面坡度陡峭，表明超聲時間與超聲功率對包封率影響顯著[27-29]。

2.3 驗證實驗結果

根據Design-Expert 10.0.4軟件分析結果，Lyco-NLC制備的最佳參考工藝條件為水化時間61.1 min、超聲時間9.8 min、超聲功率268.6 W，此時包封率預測值為88.8%。根據參考工藝條件并考慮實際可操作性，調整工藝條件為水化時間61 min、超聲時間10 min、超聲功率266.5 W，結果表明所制得的Lyco-NLC表觀為粉紅色懸濁液，證明番茄紅素成功包封于壁材內，其包封率為（90.84±0.41）%，載藥量為（2.56±0.01）%，粒徑分布如圖8所示，粒徑為（126.48±3.87）nm，多分散指數為0.188±0.028，Zeta-電位為（-48.53±2.40）mV。

圖8 Lyco-NLC粒徑分布圖Fig.8 Particle size distribution of Lyco-NLC

2.4 穩定性實驗結果

表4 穩定性實驗結果Table 4 Results of stability experiments

由表4 可知，最優工藝得到的L y c o-N L C 在貯藏30 d后，其包封率為（84.49±0.44）%，粒徑為（135.48±7.31）nm，多分散指數及Zeta-電位數據表明，采用乙醇注入-探頭式超聲法制備的番茄紅素納米結構脂質載體有較好的穩定性。

3 結 論

采用乙醇注入-探頭式超聲法聯合制備Lyco-NLC，通過單因素試驗法及星點設計-響應面法優化制備工藝，以包封率及粒徑為考察指標，考察各因素及兩兩交互后對Lyco-NLC的影響，確定Lyco-NLC最佳制備工藝為：水化時間61 min、超聲時間10 min、超聲功率266.5 W、藥脂比為1∶36、固液脂質比例為1∶6，磷酸鹽緩沖液pH值為6.8，此條件下得到Lyco-NLC包封率為（90.84±0.41）%，載藥量為（2.56±0.01）%，粒徑為（126.48±3.87）nm，多分散指數為0.188±0.028，Zeta-電位為（-48.53±2.40）mV，樣品狀態為粉紅色懸濁液。4 ℃條件下貯存30 d后，番茄紅素包封率為（84.49±0.44）%，粒徑為（135.48±7.31）nm，多分散指數為0.205±0.017，Zeta-電位為（-47.16±2.77）mV，說明此方法制備的Lyco-NLC穩定。

番茄紅素具有多種生物學功能，但化學性質不穩定，生物利用率較低[30]，在一定程度上限制其應用，乙醇注入-探頭式超聲法制備Lyco-NLC過程中無水乙醇為唯一有機溶劑，并且使用量少，無有毒性試劑的引入；星點設計-響應面法優化設計可在中心點處進行多次重現性實驗，提高實驗的準確性。采用乙醇注入-探頭超聲法制備的Lyco-NLC包封率和穩定性好，相比于其他傳統制備方法，在一定程度上提高Lyco-NLC包封率的同時，減少了有毒有機試劑的引入，可為番茄紅素功能食品開發提供一定的參考。