QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性產品中9種β-受體激動劑殘留

肖 勇，萬偉杰，鄔 磊，王冬根，周瑤敏，徐 俊

(江西省農業科學院 農產品質量安全與標準研究所/農業農村部 畜禽產品質量安全風險評估實驗室(南昌)/江西省農產品質量安全重點實驗室，江西 南昌 330200)

β-受體激動劑，俗稱瘦肉精，是具有苯乙醇胺結構的腎上腺素類的合成藥物[1]。在臨床醫學上，將其作為平喘性藥物，用于治療支氣管哮喘的相關疾病[2]。以前，β-受體激動劑在畜牧生產中被廣泛用作生長促進劑，因為它可以提高生豬的瘦肉率，減少飼料使用、使肉品提早上市、降低成本[3]。但研究發現[4-5]，β-受體激動劑化學性質和結構穩定，在動物組織中很難被分解，可通過食物鏈逐漸在人體內積累，若消費者長期食用這類食品，將可能會引起慢性或急性中毒，以及心血管和神經系統的病變，甚至可能誘發惡性腫瘤，因此中國和歐盟等許多國家均嚴厲禁止該類藥物用于畜禽生產。其實早在2002 年，我國就將β-受體激動劑列入《食用動物禁用獸藥及其他化合物清單》[6]。近幾年風險評估調查結果發現，在利益的驅使下，違法使用β-受體激動劑的現象依然嚴峻，尤其是鹽酸克倫特羅的違禁使用[7]。

目前，β-受體激動劑類藥物殘留的檢測方法主要有液相色譜法[8-9]、氣相色譜-串聯質譜法[10]、液相色譜-串聯質譜法[11-12]等。液相色譜法僅靠保留時間定性，針對復雜樣品的抗干擾能力差、靈敏度等均不能滿足當前殘留檢測的要求；氣質聯用法的前處理步驟需衍生，操作繁瑣、耗時較長；而液相色譜-串聯質譜法靈敏度高、特異性強，并且可同時檢測多種目標化合物，因此是現階段最主要的檢測技術手段。在前處理方面，常見的凈化方法分為2種：一種是固相萃取法，另一種是QuEChERS法。在固相萃取的方法中，文獻報道較多的是用PCX柱[13]、HLB柱[14]和混合型MCX柱[15]對樣品進行凈化，現行主流適用于動物源性β-受體激動劑檢測的3種國標方法[16-18]、凈化方式采用的也是固相萃取。固相萃取方法雖然凈化效果好，但前處理過程繁瑣、耗時長、效率低，不適宜用于大批量樣品的檢測。自2003年QuEChERS凈化方法[19]首次發布以來，很多報道聚焦在農產品中農藥殘留樣品處理方面，而對獸藥殘留檢測方面報道則相對較少。

本文參照《動物源性食品中β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》(中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所自建方法)[20]，利用QuEChERS凈化方式，聯合超高效液相色譜-串聯質譜建立了同時分析牛肉中9種β-受體激動劑的測定方法，優化了流動相、提取溶劑、定溶液和稀釋倍數等關鍵環節，所建立的方法簡便、快速、靈敏、實用，為動物源性食品中β-受體激動劑的監測提供了又一個快速、有效的方法，有利于提升對β-受體激動劑的監控水平，適用于在檢測機構實驗室開展大批量樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 6460-1295超高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀(美國安捷倫科技有限公司)，945605渦旋混合器(美國TALBOYS公司)，LXJ-IIB高速離心機(上海安亭科學儀器廠)，YP5102電子天平(上海光正)，S210 pH計(梅特勒-托利多儀器公司)，THZ-92B回旋式振蕩儀(上海博迅)，Milli-Q超純水儀(默克公司)，SHZ-B恒溫水浴鍋(常州金壇友聯)，N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation公司)。

試劑：特布他林標準品、沙丁胺醇標準品、萊克多巴胺標準品、克倫特羅標準品、沙丁胺醇-D標準品、克倫特羅-D9標準品(均為德國Dr.Ehrenstorfer公司提供)；西馬特羅標準品、非諾特羅標準品、氯丙那林標準品、妥布特羅標準品、噴布特羅標準品(均為德國WITEGA公司提供)；P-QuEChERS-AOAC 1202提取鹽包：內含6 g無水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉(阿爾塔科技有限公司)；F-QuEChERS-AOAC 3202多功能針式過濾器：內含150 mg無水硫酸鎂和50 mg PSA(阿爾塔科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準儲備液的配制：分別取上述9種β-受體激動劑和2種同位素內標對照品適量,精密稱取,用甲醇溶解,制得100 μg/mL β-受體激動劑的儲備液，于-20 ℃下避光儲存。

標準中間液的配制：分別移取適量9種β-受體激動劑標準儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成10.0 μg/mL的混合標準溶液；移取適量2種同位素內標儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成10.0 μg/mL的混合內標溶液，均在-20 ℃下避光儲存。

標準工作液：取上述混合標準中間液0.20 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成0.20 μg/mL的標準工作液；移取0.50 mL的2種同位素內標儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成0.50 μg/mL的混合內標溶液，均在-20 ℃下避光儲存。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×3.0 mm，1.8 μm)；柱溫40 ℃；流動相：A相0.1%甲酸水溶液，B相甲醇溶液；流速0.4 mL/min；進樣量10.00 μL；梯度洗脫步驟：0～0.50 min，維持2% B；0.50～4.00 min，2% B～35% B；4～5 min，35% B～80% B；5.00～5.50 min，80% B～90% B；5.5～5.7 min，90% B～2% B；5.7～9.0 min維持2% B。

1.2.3 質譜參數 離子源：電噴霧；掃描方式：正離子；電離電壓：4.0 kV；檢測方式：多反應監測；源溫：325 ℃；干燥氣流速：5 L/min；霧化氣壓力：50 psi；鞘流氣溫度：350 ℃；鞘流氣流速：12 L/min。優化后的多反應監測試驗條件見表1。

表1 9種β-受體激動劑和2種內標物質多反應監測參數

1.3 樣品的處理

稱取5 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，準確加入0.02 mL 0.50 μg/mL的混合內標溶液、10 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖液(pH=5.2)、0.04 mL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，振蕩10 min，于37 ℃下避光水浴酶解16 h，酶解后放置至室溫，加入10 mL 2%甲酸-乙腈溶液，再加入P-QuEChERS-AOAC提取鹽包，渦旋振蕩1 min，4500 r/min離心5 min，將離心后的上清液轉移至15 mL離心管中，在離心管中加入5 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋混合30 s，4500 r/min離心1 min。吸取下清液以逐滴流出的速度勻速通過多功能針式過濾器至15 mL離心管中，準確吸取5 mL濾液，于50 ℃氮吹至近干，先加0.25 mL乙腈復溶，渦旋30 s，再加入0.75 mL 0.1%甲酸水溶液，混勻，過0.22 μm的濾膜，上機待測。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的優化

2.1.1 提取溶劑的優化 β-受體激動劑是在苯乙醇胺結構母核的基礎上進行官能團修飾和改造后形成的一大類化合物，屬于水溶性強和極性多樣的化合物群。通過查閱文獻[21-22]，多種獸藥殘留分析中一般采用乙腈、甲醇等有機溶劑作為提取試劑，甲醇、乙腈都可以降低高脂肪、高蛋白的基質干擾，但與甲醇相比，乙腈提取時帶入的極性干擾物更少，有利于后續凈化。本研究采用空白加標(2.0 μg/kg)的方式比較了1%甲酸-乙腈[23]、2%甲酸-乙腈[24]、5%甲酸-乙腈[25]、0.1%乙酸乙腈[20]、2%乙酸乙腈、5%氨水乙腈[26]、80%乙腈-水[27]、純乙腈等8種溶劑提取，定溶液選擇0.1%甲酸水∶甲醇=9∶1。結果表明：在提取溶劑乙腈中加入適當的酸后，9種化合物的回收率普遍較高，其可能原因是β-受體激動劑一般是弱堿性化合物[24]，在酸性溶液中呈現離子狀態有利于提??；在酸性條件下，西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林和克倫特羅均有較理想的回收率(>80%)，但萊克多巴胺只有在2%甲酸-乙腈、5%甲酸-乙腈的提取條件下能實現優于其他提取劑的回收，另外特布他林在5%甲酸-乙腈的提取條件下的回收率明顯低于2%甲酸-乙腈，故試驗選擇2%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑(圖1)。

圖1 不同提取溶劑的回收率比較

2.1.2 定溶液的選擇 樣品上機前復溶液的確定直接影響方法的靈敏度，本文比較了定溶液中不同有機相比例后發現，在定溶液中加入一定比例的有機相可明顯提高對噴布特羅的響應[28]，可有效地提高其回收率。但使用有機相比例過大時，如在使用v0.1%甲酸水∶v乙腈=1∶1[19]時發現，西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅和特布他林的出峰均出現分叉的情況，峰型較差，結果如圖2所示。

圖2 使用v0.1%甲酸水∶v乙腈=1∶1作為定溶液峰型分叉效果圖

最后，本試驗比較了文獻報道中常見的5種定溶液組合的回收率，定溶液分別為v0.1%甲酸水∶v甲醇=9∶1[29]、0.1%甲酸水[14,24,30]、350 μL甲醇+650 μL 0.1%甲酸水[23]、250 μL乙腈+750 μL 0.1%甲酸水、v0.1%甲酸水∶v乙腈=9∶1[24]，結果如圖3所示。定溶液中水相與有機的比例對極性敏感物質有一定的影響，本試驗先用250 μL乙腈對氮吹干后的物質進行渦旋復溶，然后再加750 μL 0.1%甲酸水混勻，如此操作下各種化合物的峰型和回收率均達到滿意的效果。

圖3 5種定溶液試驗所得各種化合物的回收率

2.1.3 流動相選擇 基于β-受體激動劑類藥物均具有較強的水溶性，而且本研究中的9種化合物既有極性(如沙丁胺醇)，也有弱極性(如克倫特羅、妥布特羅)，還有非極性(如噴布特羅)等，所以需要選擇合適的流動相才能將各種物質在不同的時間被洗脫下來，從而達到有效分離的目的。有文獻表明，在正離子掃描的模式下，流動相加入一定量的甲酸可以提高離子化效率和分離度[31-32]，故本文比較了甲醇、乙腈作為有機相分別與0.1%甲酸溶液組成流動相的效果。結果表明：將甲醇作為有機相時，各種化合物響應值較高；而當甲醇中加入0.1%甲酸后，對待測物響應強度的影響不大，因此本研究選擇0.1%甲酸水-甲醇溶液作為流動相。在該流動相體系下，所有化合物的峰型尖銳，相互無干擾，并且可以在7 min內完成目標物的分離和色譜柱的分離。各種目標化合物的選擇離子流色譜圖見圖4。

圖4 各種目標化合物的選擇離子流色譜圖

2.2 標準曲線、線性范圍及定量限

本方法通過使用基質標準曲線對9種β-受體激動劑進行分析，以基質標準工作液的濃度作為橫坐標，各種藥物定量離子對峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數。β-受體激動劑在0.25～10.00 ng/mL范圍內線性關系良好，各種藥物的回歸方程及相關系數見表2。試驗采用在空白牛肉中添加目標組分的方法，依據定性或定量離子對色譜峰的信噪比大于10為定量限，得出各種藥物的定量限為0.25 μg/kg。

表2 牛肉中9種β-受體激動劑的標準曲線

2.3 精密度與回收率試驗

取0.25、0.50、2.50 μg/kg共3個梯度水平的陽性添加試樣，按照“1.3樣品的處理”的步驟操作，每個濃度進行5個平行試驗，以相對標準偏差(RSD，%)計算精密度，以實測濃度與理論添加濃度之比，計算各個被測物質的方法回收率，結果在低(0.25 μg/kg)、中(0.50 μg/kg)、高(2.50 μg/kg)濃度下，β-受體激動劑的精密度小于10%，回收率在67.73%～114.13%之間，具體結果見表3。

表3 β-受體激動劑的精密度和回收率(n=5)

2.4 實際樣品的分析

對日常檢測任務中收集的4份陽性牛肉樣品(T1、T2、T3、T4)，分別選用本方法、國標GB/T 21313—2007和農業農村部1025號公告-18—2008中的方法進行了測試，樣品中均檢出有克倫特羅，結果見表4。說明該方法能夠實現對牛肉中β-受體激動劑的殘留檢測。

表4 實際樣品分析結果 μg/kg

3 結論

本研究以2%甲酸-乙腈溶液作為提取劑，采用QuEChERS前處理技術，結合高效液相色譜-串聯質譜技術，通過優化前處理條件和質譜參數，建立了快速測定牛肉中9種常見β-受體激動劑殘留的方法，大大簡化了前處理過程；結合新型凈化方法，降低了基質對分析物的干擾，提高了樣品的檢測效率，使得檢測更加準確、可靠，為今后畜產品中受體激動劑的殘留檢測提供了一種新的方法。