基于細胞集群效應的高濃度燃料乙醇發酵研究

汪 虎，劉慶國，陳 勇*，李 義

(1.安徽省宿州中糧生物化學有限公司，安徽 宿州234000；2.南京高新工大生物技術研究院有限公司，江蘇 南京210032；3.吉林中糧生化有限公司，吉林 長春 130033)

乙醇作為一種特殊的化學品被廣泛應用于化工、食品及醫療行業，也被用作于燃料添加劑和汽油增強劑[1]，甚至被視為未來的能源替代品。目前燃料乙醇主要依賴于生物發酵法生產，然而傳統生物發酵法存在天然缺陷，如機械性損傷及不適的液體環境導致的酵母細胞生長穩定性和耐受性較差、易發生顯著的細胞衰亡和自溶現象以及時空效率低等[2,3]。另外，大接種量發酵導致碳源流向菌體生長代謝，降低了淀粉糖利用效果，從而表現為較低的糖醇轉化率。生物發酵的低時空效率和低產物得率使得燃料乙醇發酵技術的成熟度偏低，生產成本偏高[4]。

與傳統游離細胞發酵相比，固定化酵母細胞發酵具有許多優勢，如細胞濃度高、對產物抗性強、催化劑重復使用等[5-6]。酵母細胞固定化主要有兩種方法：吸附法和包埋法。包埋載體一般會存在載體降解和傳質受限的問題，如瓊脂、凝膠、卡拉膠和海藻酸鈣等。吸收材料是一種簡單廉價的固定化細胞的載體，傳質效果明顯優于包埋材料[7]，如高粱甘蔗渣[8]、硅藻土[9]、玉米秸稈[10]、多孔陶瓷[11]、海綿[12]和蠶繭[7]等。然而這些載體多存在發酵空間利用率低、生物抗降解性能差以及對原料來源要求高等缺陷。

本研究首次以改良纖維為吸附載體，進行高濃度產物耐受性試驗，并以陳化糧(水稻)為原料，進行高濃度燃料乙醇發酵研究，為乙醇高濃度工業化生產應用提供參考。

1 材料及方法

1.1 菌種

安琪耐高溫釀酒酵母。

1.2 培養基及培養條件

1.2.1 培養基 活化培養基：麥芽汁固體培養基(麥芽250 g/L磨碎過濾，加瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min，備用)。

種子培養基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、硫酸銨4 g/L、硫酸鎂0.5 g/L；115 ℃滅菌15 min，備用。

發酵培養基：酵母膏3 g/L、蛋白胨4 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀 3 g/L、硫酸銨 4 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、7水合硫酸亞鐵0.05 g/L、7水合硫酸鋅0.05 g/L；115 ℃滅菌15 min，備用。

1.2.2 培養條件 (1)種子培養：挑取一環經麥芽汁活化的斜面種子于200 mL的種子液中，并置于溫度30 ℃、轉速150 r/min的搖床培養18 h。

(2)菌種擴大培養及固定：將裝有6 g毛巾的500 mL的錐形瓶加入200 mL新鮮種子培養基，115 ℃滅菌15 min。冷卻至室溫后，量取10%(體積分數)的種子液加到錐形瓶中。再置于溫度30 ℃、轉速100 r/min的搖床上固定36 h。

(3)固定化細胞發酵：將固定結束后的廢液倒出，加入含有不同葡萄糖濃度和乙醇濃度的新鮮發酵培養基，于溫度33 ℃、轉速100 r/min的搖床上培養若干時間。該實驗為破壞性實驗，每個時間點設3個平行搖瓶，每隔3 h取一次樣，共取9次。

(4)游離細胞發酵：向500 mL的錐形瓶加入200 mL新鮮種子培養基，115 ℃滅菌15 min。冷卻至室溫后，量取10%(體積分數)的種子液加到錐形瓶中。再置于溫度33 ℃、轉速100 r/min的搖床培養，培養時間與固定化細胞擴大及固定階段的時間相同；再以4000 r/min，離心5 min。離心后的酵母重新溶在200 mL的含有不同乙醇濃度的新鮮培養基中。每個乙醇濃度做3個平行搖瓶，每隔3 h取一次樣，共取9次。

(5)水稻發酵實驗：固定化過程同耐受性試驗過程。在正式發酵前，將種子培養基中的葡萄糖濃度替換成240 g/L(避免載體吸水稀釋發酵過程中的乙醇濃度，對后面正式發酵產生影響)，培養24 h。結束后進行正式發酵。發酵時，發酵培養基用水稻水解液替代。在單批發酵(游離和固定化)中，每個時間點設3個平行樣，總共6個取樣時間點，發酵時間48 h。在間歇式發酵過程中，發酵時間48 h下瓶取樣分析，同時換液進行下一批發酵。以上發酵條件均為：轉速150 r/min，溫度34 ℃。

1.3 分析方法

OD測定：將游離酵母稀釋一定倍數，通過可見分光光度計，在波長為660 nm的條件下檢測；固定化酵母通過震蕩從纖維床上解離下來，然后用上述方法測得OD值。細胞濃度與OD的標曲：1 OD=0.81 g DCW/L=1×107個/mL。

糖測定：葡萄糖測定用生物傳感分析儀SBA。還原糖：采用DNS法[4]?？偺呛康臏y定：取適量的樣品加入50 mL離心管中，然后加入5 mL濃硫酸和5 mL純水，沸水浴10 min，使總糖完全水解。置于冰水中冷卻后，加一滴酚酞指示劑，用6 mol/L的NaOH中和至微紅色，最后定容至50 mL。之后按照上述DNS的測定方法測定水解后的還原糖的含量，即總糖含量。

酒度測定：取100 mL發酵液，加熱蒸餾，定量到100 mL，用酒度計進行測量。

乙醇測定：采用氣相色譜法，初始柱溫70 ℃，升溫速率20 ℃/min，終止溫度為190 ℃；前進樣口溫度180 ℃，前檢測器溫度220 ℃；氫氣流速30 mL/L，空氣流速200 mL/L，氮氣流速30 ml/L。

細胞數測定：采用血球計數法，取2.5 mL混勻樣品放入100 mL容量瓶中，加1 mL次亞甲基藍；定容、靜置1 min，置于血球計數板上，用顯微鏡計量細胞個數，其中，死亡率=染色細胞數/總細胞數[4]。

酸度(酸堿滴定法)測定：于150 mL三角瓶中注入20 mL蒸餾水，加兩滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至微紅色，再吸取過濾醪液1 mL繼續用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至再次出現粉紅色，在30 s內不消失為終點，第2次氫氧化鈉滴定毫升數乘以10為酸度。

乙醇轉化率/%=乙醇濃度/(總糖濃度×0.511)×100%。

掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察：對纖維床固定化酵母先進行真空冷凍干燥，然后利用掃描電鏡(model JSM-6010；JEOL Ltd.，Tokyo，Japan)觀察細胞形態。游離細胞離心后加入3.5%的戊二醛，并在4 ℃下保存 15 h，用純水洗2次。用初始濃度為20%、最終濃度為100%、梯度濃度為20%(體積分數)的乙醇進行脫水，再用六甲基二硅氮烷進一步處理[9]，最后進行電鏡掃描。

2 結果及分析

2.1 細胞耐受性分析

2.1.1 不同乙醇濃度對游離和固定化細胞培養的影響 游離和固定化細胞對不同乙醇壓力下的響應如圖1所示。當乙醇濃度在0～4%(體積分數)之間時，兩者葡萄糖在3 h內均消耗徹底，糖消耗速率差別不明顯；但固定化酵母細胞生長速率快于游離細胞，總細胞濃度顯著高于后者。隨乙醇濃度增加(8%～16%，體積分數)，游離酵母細胞對葡萄糖的消耗速率逐漸下降。當乙醇濃度提高至16%(體積分數)時，游離細胞培養體系中葡萄糖消耗不完全，而固定化細胞體系雖然在后期葡萄糖轉化速率有變慢現象，但不顯著，且能消耗完全。固定化細胞生長速率和細胞濃度依然高于游離細胞水平。當乙醇濃度為16%(體積分數)時，兩者菌體濃度在培養中后期都有明顯的下降趨勢，這可能是因為高乙醇濃度抑制和營養缺乏，使得酵母開始裂解。當初始乙醇濃度設定到20%(體積分數)時，游離細胞培養體系的葡萄糖幾乎不被消耗，同時細胞濃度一直處于下降趨勢，這說明菌體已趨于死亡；然而固定化細胞培養體系的葡萄糖呈下降趨勢，雖于27 h時葡萄糖未被消耗徹底且菌體生長有明顯的抑制現象，但依然能保持較高的酵母活性。結果表明，基于糖耗及菌體生長現象，固定化酵母細胞具有較強的乙醇耐受性，而且隨著初始乙醇濃度的提高，兩者的差距也越明顯。

圖1 乙醇對游離及固定化細胞培養的影響

2.1.2 細胞形態分析 圖2為游離及固定化酵母細胞的掃描電鏡圖，其中圖B、C、D顯示了固定化細胞形成生物膜過程的3個時期：吸附、聚集、成膜。在固定化階段，剛開始細胞成懸浮狀態，只有少量細胞在靜電、氫鍵和范德華等作用力下較弱地吸附在載體上(圖2B)；隨著搖動培養，越來越多的細胞開始聚集(圖2C)；聚集的細胞形成細胞層，即所謂的生物膜。生物膜細胞靠自身產生一種透明的膠狀物質，這種膠狀物覆蓋在生物膜之上，緊緊地將生物膜細胞結合在一起。不同于固定化細胞，游離細胞在電鏡觀察下都成分散狀態。

A：游離；B：固定化酵母吸附過程；C：聚集過程；D：生物膜形成。

研究發現，生物膜能提供一種微環境，這種微環境有利于誘導抵抗有毒溶劑的基因表達。在本實驗中，我們觀察到載體上的細胞明顯地被一層透明物質包埋，即胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)。這種EPS可能是由多糖、蛋白、核苷酸和磷脂等一種或多種物質組成[13]。當細胞處于高濃度條件下時，聚集的細胞之間通過信號傳導，誘使與乙醇耐受性相關的基因表達，從而產生這種EPS。EPS覆蓋在細胞表面，通過屏障作用抵抗乙醇的毒害，從而達到保護細胞的目的，同時也促進了細胞增長。當固定化的細胞從載體上釋放出來時，因為生物膜被破壞而恢復成游離細胞的生理特性(圖3)。這個現象也與文獻報道的結果一致[14]。結果表明，固定化技術可以促進表面細胞形成生物膜，形成集群效應，從而提高對乙醇的耐受性。

F1：第1批的游離細胞培養；I1：第1批的固定化細胞培養；F2：第2批游離細胞培養；I2：第2批固定化細胞培養；R2：第2批釋放出來的細胞培養。

2.2 高濃度乙醇發酵

2.2.1 單批發酵對比 由圖4可知，相對于傳統的燃料乙醇發酵，高濃度乙醇發酵具有明顯的優勢。首先，可以提高設備利用率。在產量相同的條件下，高濃度乙醇發酵所占發酵體積小，減少了對罐體的使用。其次，降低生產能耗。高濃度發酵中用水量較少，后期乙醇濃度高，降低了分離過程中蒸餾成本[15-16]。此外，高糖度產生的高乙醇濃度可以降低染菌概率，提高生產效率。

基于固定化細胞的集群效應，作者采用水稻液化醪進行高濃度乙醇發酵。如圖4所示，在發酵初始階段，相比于游離發酵，固定化發酵體系殘總糖濃度下降較快。在游離發酵體系，殘還原糖濃度有一個明顯上升的過程，且殘還原糖水平偏高，說明相比于固定化發酵，游離發酵前期耗糖速率較慢，且明顯滯后于糖化速率。同時，在固定化發酵體系，乙醇產量相應上升較高。但整個過程，固定化體系中游離細胞濃度上升緩慢，總體濃度不高。發酵至終點時，游離發酵殘糖總糖2.97 g/100 mL，殘還原糖1.72 g/100 mL，酒度14.1%(體積分數)；而固定化發酵殘總糖1.58 g/100 mL，殘還原糖0.20 g/100 mL，酒度15.2%(體積分數)。另外，從圖5可以明顯觀察到，在固定化發酵體系中，游離酵母形態幾乎呈圓形，且被染色的數量較少；而在游離發酵體系中，酵母形態呈拉長的橢圓形，死亡量較多；而且在發酵終點時，固定化發酵體系的游離細胞死亡率在30%左右，遠遠低于游離發酵體系(>78%)，說明固定化發酵體系的細胞抗衰老能力明顯增強。以上結果表明，固定化細胞具有較高的群體抗逆性，使得發酵能力顯著高于游離發酵，這與我們之前的研究結果[17-18]較為一致。

A：15%種子的游離細胞發酵;B：固定化細胞發酵。

圖5 發酵40 h，游離(A)和固定化細胞發酵(B)體系中游離細胞的形態

2.2.2 間歇式發酵的穩定性 為了評估間歇式發酵在高濃度條件下的穩定性，進行了9個批次的間隙式發酵。如表1所示，固定化發酵每批游離酵母數較為穩定，在0.7～1.0之間波動。殘總糖和還原糖分別在1.74、0.25 g/100 mL左右，變化不顯著。平均乙醇濃度為122.71 g/L，平均酒度達15.18%(體積分數)；總糖平均轉化率為93.47%。這些結果說明，以水稻液化液為發酵原料進行固定化酵母高濃度乙醇發酵的體系是穩定的，其發酵方式也是可行的。

表1 單批和間隙式發酵結果對比

3 結論

分析了游離和固定化酵母基于糖耗及菌體生長方面的抗乙醇特性，結果發現固定化酵母表現出較強的乙醇耐受性。游離酵母在乙醇濃度為16%(體積分數)時出現嚴重的抑制現象，而固定化酵母即使在20%(體積分數)的高乙醇濃度下依然可以進行代謝活動。

固定化技術可以促進表面細胞形成生物膜，形成集群效應，提高了對環境的抗逆性，增強了發酵能力。與傳統游離發酵相比，固定化細胞發酵體系反應速率明顯加快，且殘總糖水平和細胞水平明顯低于前者，從而表現為較高的乙醇轉化率。

在間歇式發酵中，固定化發酵批次之間較為穩定，殘總糖水平為1.74 g/100 mL，乙醇濃度為15.18%(體積分數)，轉化率達93.47%，比游離發酵高5.1個百分點，結果說明，以水稻液化液為發酵原料進行固定化酵母高濃度乙醇發酵具有可行性。