銀耳白霉病病原菌的分離鑒定及其生物學特性

劉 芳，袁宗勝，嚴俊杰，黃珊珊，謝寶貴*

(1.福建農林大學 菌物研究中心,福建 福州 350002;2.閩江學院 海洋研究院,福建 福州 350108)

銀耳(TremellafuciformisBerk),又稱白木耳、雪耳,其在真菌的分類學地位中歸屬于擔子菌門、傘形亞門、銀耳綱、銀耳目、銀耳科、銀耳屬[1,2]。銀耳富含膠質、膳食纖維和鈣,可降低血液和肝臟中的膽固醇,有助于體內廢物排除、肝臟解毒[3,4]。在銀耳蛋白質中富含17種氨基酸,這些氨基酸和酸性異多糖、有機磷、有機鐵等化合物能增強人體的免疫能力[5-8]。

新鮮的銀耳子實體顏色是潔白色或乳白色的,有許多薄而波卷狀褶的瓣片,叢集成牡丹花狀,瓣片不分叉或在頂部分叉,表面光滑,富有彈性,直徑8～16 cm[9]。從廣義上來說,銀耳菌絲包括銀耳純菌絲(純白菌絲,俗稱白毛團,屬擔子菌)和香灰菌絲(羽毛狀菌絲,屬子囊菌)[10]。由于銀耳純菌絲和香灰菌絲在生態條件上存在差異性,再加上銀耳菌絲體本身具有生理特殊性[11],所以在銀耳制種上以及在銀耳生長發育過程中很容易發生病害。

2017年我們在福建省三明市尤溪縣銀耳生產菇房內發現了白霉菌感染的病害,該病害發展迅速,在發現該病害的菇房內約有10%的銀耳受到了白霉菌的影響,并且發病后的銀耳已不適合食用,該病害的發生對銀耳生產造成了極其嚴重的經濟損失(此前尚未見相關文獻報道),為此本文對其病原菌進行了分離鑒定,并分析了其生物學特性,旨在為后續病害防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 培養基與主要試劑

病原真菌的分離培養采用PDA培養基，其配方為:新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL。PDB培養基配方:新鮮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL。

病原真菌DNA提取和ITS片段擴增所用的引物、Marker、dNTPs、Buffer、溶菌酶等試劑為生工生物工程(上海)股份有限公司產品, 其余試劑均為國產分析純。

1.2 病原菌的分離純化

在無菌條件下,將受感染的銀耳子實體發病部位切下一個小組織塊,接種于添加1倍氨芐的PDA抗性平板上,用封口膜封口后正置于25 ℃的恒溫培養箱中進行培養。在培養5～6 d后,在PDA抗性平板上觀察到生長受限和不規則邊緣的小型乳白色真菌菌落,在長出菌落后進行單孢分離純化,直到分離出純培養物。

1.3 病原菌的致病性測定

從純化的平板上挑取一小塊菌絲，將其轉移到PDB培養基中,置于150 r/min的搖床上30 ℃恒溫培養10 d。然后用過濾法將菌絲體與PDB分離,用濾液制成孢子懸浮液(1×107conidia/mL)。用濃度為1×107conidia/mL的孢子懸浮液噴灑于正常生長的銀耳子實體上,以噴灑無菌蒸餾水為對照,確保供試的銀耳菌體的每一個子實體都被噴上孢子懸浮液。銀耳子實體培養室的溫度控制在23 ℃,相對濕度控制在95%。

在參加病原物致病性實驗的銀耳子實體產生病害現象后，按照1.2中的方法重新分離病原菌,同樣以無菌水噴灑健康銀耳子實體為對照。觀察所產生的癥狀，以確定是否為同一病原菌。

1.4 病原菌形態觀察與ITS序列鑒定

1.4.1 病原菌形態觀察 平板觀察:將得到的純化培養物在PDA平板上25 ℃恒溫培養15 d左右,觀察PDA平板上病原菌菌絲的生長發育情況。

顯微鏡觀察:在潔凈的載玻片上滴加10 μL的蒸餾水,用解剖針挑取在PDA平板上25 ℃恒溫培養15 d左右的病原菌單個菌落到載玻片上,蓋上蓋玻片并滴加棉蘭染色液,吸去多余的染色液；在靜置染色1 min后用普通光學顯微鏡進行觀察。另外還通過掃描電子顯微鏡進行觀察。

1.4.2 病原菌rDNA ITS序列的測定與分析 采用CTAB法提取病原菌的DNA,并對提取的DNA進行下一步的PCR擴增,PCR擴增選用的引物是真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；將PCR擴增得到的產物經過質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行專業測序。將測序結果在GenBank(NCBI, http://www.ncbi.nlm.gov)中進行BLAST同源性分析。用MEGA 5.0軟件采用最大似然法(maximum likelihood)構建系統發育樹,Bootstrap檢驗的重復次數為1000次。

1.5 病原菌生物學特性的測定

1.5.1 溫度對病原菌菌絲體生長的影響 將病原菌在PDA平板上培養12 d,然后用直徑為6 mm的打孔器打取菌落圓片,用接種針將菌落圓片接種至PDA平板中心,置于不同溫度下恒溫培養,溫度設置35、30、25、20、15、10、5 ℃共7個處理,每個處理3次重復,定期觀察菌落的生長情況,測量菌落直徑,計算菌絲體的生長速度。

1.5.2 pH值對病原菌菌絲體生長的影響 在無菌條件下,將融化好的PDA培養基用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl調節pH值,pH值設置10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5共12個處理。用接種針將病原菌菌落圓片接種到不同pH值的PDA平板中心,置于25 ℃下恒溫培養,每個處理3次重復。定期觀察平板上的菌落生長情況,測量菌落直徑,計算菌絲體的生長速度。

1.5.3 碳源對病原菌菌絲體生長的影響 以葡萄糖為碳源的基礎培養基為對照組,采用蔗糖、麥芽糖、淀粉作為碳源來替代葡萄糖作為處理組。用接種針將病原菌菌落圓片接種到以上不同碳源的PDA平板中心,置于25 ℃下恒溫培養,每個處理3次重復。定期觀察平板上的菌落生長情況,測量菌落直徑,計算菌絲體的生長速度。

1.5.4 氮源對病原菌菌絲體生長的影響 以蛋白胨為氮源的基礎培養基為對照組,分別用酵母粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉來代替蛋白胨作為處理組。用接種針將病原菌菌落圓片接種到以上不同氮源的PDA平板中心,置于25 ℃下恒溫培養,每個處理3次重復。定期觀察平板上的菌落生長情況,測量菌落直徑,計算菌絲體的生長速度。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離純化與致病性

銀耳白霉病在發病初期出現針狀小白點,與銀耳耳片顏色相近,不易被肉眼察覺。隨著菇房內溫度和濕度的逐漸升高,這些白色的針狀小點迅速生長成為肉眼可見的白色真菌物質,擴散成一層白色絨毛狀的真菌物質，覆蓋在銀耳耳片的表面(圖1B)。隨著病害的進一步發展,整個銀耳子實體腐爛,耳片膠化,整朵銀耳腐壞變成淺黃色的膠狀物質。病原菌在25 ℃的恒溫培養箱中培養5～6 d后,在PDA抗性平板上生長至一定程度后不再擴散,并形成不規則邊緣的小型乳白色真菌菌落；在長出菌落后進行單孢分離純化,直到分離出純培養物。

在供試銀耳子實體上噴灑孢子懸浮液1 d后,在每個子實體的表面觀察到白色真菌菌落(圖1C、圖1D)；在繼續培養后會產生淺黃色膠狀物質(圖1E)；所產生的癥狀與原始樣本中發現的癥狀完全一樣,而對照組則無癥狀。從接種發病病斑上再次分離的病原菌與接種病原菌相同,證明所接病原菌為銀耳白霉病的致病菌。

A:正常銀耳子實體。B:發病銀耳子實體。C:回接1 d后的銀耳耳片。D:回接后的整個銀耳子實體。E:回接發病最后的銀耳子實體。

2.2 病原菌的形態觀察與鑒定

2.2.1 病原菌平板觀察 病原菌在PDA平板上25 ℃恒溫培養15 d左右,觀察發現菌絲為純白色,菌絲之間通過相互交叉分支進行生長,逐漸生長成為肉眼可見的菌落并產生分生孢子。該病原菌是通過擲孢子進行生長繁殖的(圖2A)。

2.2.2 顯微鏡觀察 普通光學顯微鏡觀察結果表明,病原菌菌絲細,有分支,無隔膜的菌絲寬度約為2.5 μm;在菌絲尖端或周圍有許多分生孢子,分生孢子的長度約為10 μm,寬度約為5 μm,呈現一個彎彎月亮的形態。該病原菌的分生孢子著生方式為頂端著生,在孢子成熟后直接掉落在菌絲周圍或者以擲孢子進行擴散生長(圖2B)。

掃描電鏡顯微觀察結果(圖2C)顯示：孢子的著生方式為頂端著生；未成熟將要掉落的孢子沒有明顯的彎月亮形狀；成熟的孢子與菌絲之間的連接梗越來越細,直到孢子成熟后擲出去。

A:在PDA培養基表面的擲孢子菌落。B:普通光學顯微鏡400倍下頂端著生的分生孢子。C:掃描電子顯微鏡7000倍下的分生孢子。

2.3 病原菌rDNA ITS序列的分析

對經過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測的ITS片段的測序結果進行分析,顯示該病原菌的rDNA ITS片段長度為1184 bp。將該序列提交給NCBI基因庫,所得到的登錄號為MG806985。在NCBI上進行BLAST同源性分析，結果表明,該病原菌與Melanotaeniumendogenum和Melanotaeniumcingens的序列重復性為49%,最為接近。通過建立系統發育樹(圖3),發現該病原菌與Melanotaeniumendogenum在同一個分支上,確定該病原菌屬于黑粉菌屬(Melanotaenium)。

括號中的序號表示菌株的GenBank登錄號;各分支點顯示的數字代表通過1000次重復運算得到的置信值。

2.4 病原菌的生物學特性

2.4.1 溫度對菌絲體生長的影響 病原菌菌絲平均生長速度計算結果(圖4)表明,該病原菌在不同的溫度條件下菌絲生長速度存在很明顯的差異。該病原菌在15～30 ℃的PDA平板上均可以生長；當培養溫度為25 ℃時菌絲生長速度最快,達3.18 mm/d,遠遠高于在其它溫度下的生長速度；當溫度低于15 ℃或者超過35 ℃時菌絲停止生長。因此，確定該病原物菌絲生長的最適溫度為25 ℃。

圖4 溫度對菌絲體生長的影響

2.4.2 pH值對菌絲體生長的影響 病原菌菌絲平均生長速度計算結果(圖5)表明,該病原菌在所設定的12個pH值下均可以生長,其中生長速度最快即最適的pH值為4.5。另外，病菌菌絲體在偏酸性和偏堿性的條件下均生長良好,并且酸性越大和堿性越大菌絲生長越好,說明該病原菌的菌絲生長對pH的要求呈現兩極化。

圖5 pH值對菌絲體生長的影響

2.4.3 碳源對菌絲體生長的影響 圖6的結果表明,該病原菌對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉4種碳源均能加以利用,其中對淀粉的利用率最高,其次是葡萄糖,而對麥芽糖和蔗糖的利用率較低。

圖6 碳源對菌絲體生長的影響

2.4.4 氮源對菌絲體生長的影響 病原菌菌絲平均生長速度計算結果表明,該病原菌對蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉5種氮源均可加以利用,其中對硝酸鈉的利用率最高,其次是蛋白胨和尿素,而對酵母粉和硫酸鈉的利用率較低(圖7)。

圖7 氮源對菌絲體生長的影響

3 結論與討論

本研究結果表明：銀耳白霉病的病原菌屬于黑粉菌屬(Melanotaenium),該病原菌與Melanotaeniumendogenum和Melanotaeniumcingens的序列重復性僅為49%,說明該病原菌極有可能為一個新的物種；該病原物菌絲生長的最適溫度為25 ℃,這與寄主銀耳菌絲的最適生長溫度(22～25 ℃)及子實體的最適生長溫度(20～25 ℃)吻合,故不能通過溫度控制來抑制該病害的發生；該病原菌對酸堿度的適應能力很強,在pH 4.5～10.0范圍內均能生長良好，但菌絲生長的最適pH值為4.5;該病原菌對多種氮源、碳源均可吸收利用,是一種生長能力很強的真菌。

銀耳病害的發生是由多種因素決定的,除病原菌外,環境條件和寄主也極為重要[12]。每種病原菌均有一定的寄主范圍,只能侵染某種或幾種食用菌；即使對于同一種食用菌，不同品種、品系或個體在發病程度上也有一定的差距。該病原菌對其它的食用菌會不會造成同樣的危害,以及該病害的致病機制等還有待進一步研究。