胸水中LPS、IL-35、RORα在結核性胸腔積液中的表達變化及臨床意義

吳艷飛 張令

湖北文理學院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科441000

胸膜炎是由各種致病因素刺激胸膜所致的胸膜炎癥,結核性和癌性是其主要病因[1]。結核性胸膜炎與惡性胸膜炎的鑒別診斷通常需要結核分枝桿菌的檢出或胸膜活檢的陽性報告,但胸腔積液中結核分枝桿菌含量低,涂片檢測抗酸桿菌陽性率＜5%,且胸膜活檢存在有創(chuàng)、標本采集困難、重復性差等不足,因此目前臨床鑒別診斷結核性胸膜炎與惡性胸膜炎比較困難[2]。IL-35是一種由調(diào)節(jié)性T 細胞分泌的抑制性細胞因子,具有抑制細胞增殖、抑制炎癥反應等作用,還與感染性疾病、呼吸系 統(tǒng) 疾 病 等 密 切 相 關[3]。 脂 多 糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌細胞壁主要成分,由脂質和多糖構成,能夠釋放內(nèi)源性活性因子,誘導肺部損傷[4]。維甲酸相關孤兒受體α(retinoic acid related orphan receptorα,RORα)是ROR 家族中的重要一員,在淋巴細胞發(fā)育、腦部發(fā)育等生理過程中具有重要調(diào)控作用,并與結核病有關[5]。既往研究報道[6-7]胸水LPS、IL-35、RORα水平檢測有助于了解結核性胸膜炎病情,但其多為回顧性分析,且存在樣本小、時間短等不足。因此,本研究分析了胸水LPS、IL-35、RORα在結核性胸腔積液中的表達變化及臨床意義,以期為臨床鑒別診斷結核性和惡性胸膜炎提供理論基礎,現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 采用回顧性研究方法,經(jīng)襄陽市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,選擇2017年1月至2020年1月襄陽市中心醫(yī)院收治的79例結核性胸膜炎患者為結核組,66例惡性胸膜炎患者為惡性組。結核組中男47例,女32 例,年齡范圍為18～77歲,平均年齡 (48.56±10.54)歲;體質量指數(shù)(22.46±2.71)kg/m2;吸煙史47例;飲酒史32例。惡性組中男40例,女26例,年齡范圍為18～78 歲,平均年齡 (49.99±10.28)歲;體質量指數(shù) (22.58±2.65)kg/m2;吸煙史38例;飲酒史26 例;發(fā)病原因:肺癌胸腔轉移44例,胸膜間皮瘤9例,胃癌胸腔轉移8例,婦科惡性腫瘤胸腔轉移5例。惡性組與結核組性別、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計學意義,具有可比性。

1.2 納入和排除標準 納入標準:(1)結核性胸膜炎經(jīng)結核菌細菌學檢查和病理學檢查確診[1];(2)惡性胸膜炎經(jīng)胸腔鏡取胸膜病理活檢或胸水脫落細胞學檢查確診[2];(3)無凝血系統(tǒng)疾病;(4)依從性好,能配合完成本研究;(5)所有研究對象及家屬知情同意并簽署知情同意書。排除標準:(1)合并精神系統(tǒng)疾病、風濕性疾病、感染性疾病、心血管疾病、甲狀腺疾病、傳染性疾病、內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病、代謝性疾病;(2)機體重要臟器功能不全;(3)入院前接受任何與惡性胸膜炎和結核性胸膜炎有關的治療;(4)結核病與惡性腫瘤同時存在;(5)妊娠期或哺乳期婦女;(6)入院資料不齊全。

1.3 研究方法 2組患者入院后收集其相關信息,包括年齡、性別、體質量指數(shù)、飲酒史、吸煙史等,然后對2 組患者行胸腔穿刺術。采集胸水10 ml,采用北京北加美因生物技術有限公司的XL90 超速低溫離心機,離心半徑為15 cm,3 000 r/min離心10 min,分離上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測胸水LPS、IL-35、RORα水平,儀器為北京華安麥科生物技術有限公司的HF4500酶標儀,LPS試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司,IL-35試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司,RORα試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。所有操作由同一名經(jīng)驗豐富的專業(yè)檢驗科醫(yī)師嚴格按照說明書進行。

胸腔穿刺術操作如下:患者取坐位,面向椅背,雙手前臂平放在椅背上,前額伏于前壁上。胸腔穿刺抽液之前,先進行胸部叩診,選擇實音明顯的部位,用碘酒或酒精消毒穿刺點部位皮膚。解開穿刺包,佩戴無菌手套,檢查穿刺包內(nèi)器械是否齊全,穿刺針是否通暢。鋪蓋消毒洞巾,采用2%普魯卡因溶液,在穿刺點肋骨上緣,從皮膚到胸膜壁層,行局部麻醉。在麻醉藥注射前要回抽,觀察無血液、胸水、氣體后方可推注麻醉藥。

酶聯(lián)免疫吸附試驗操作如下:在酶標包被板上設標準品孔10孔,用標準品稀釋液梯度稀釋標準品。稀釋后各孔加入待測樣品50μl,37 ℃溫育30 min,洗滌緩沖液洗滌5次;每孔加入酶標試劑50μl,37 ℃溫育30 min,洗滌緩沖液洗滌5 次;先后加入顯色劑A 50μl、顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min,每孔加終止液50μl;終止反應 (藍色立轉黃色)后15 min內(nèi)以空白孔調(diào)零,450 nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例(%)形式表示,采用χ2檢驗進行比較。計量資料以±s 表示,采用t檢驗進行比較。采用spearman 相關分析胸水LPS、IL-35、RORα水平與結核性胸膜炎的相關性,采用多因素logistic回歸分析結核性胸膜炎的影響因素,采用受試者工作特征曲線分析胸水LPS、IL-35、RORα對結核性胸膜炎與惡性胸膜炎的鑒別診斷價值。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組胸水LPS、IL-35、RORα水平比較 結核組胸水LPS水平顯著高于惡性組 (t=2.691,P ＜0.05);結核組胸水IL-35水平顯著高于惡性組(t=2.908,P ＜0.05);結核組胸水RORα水平顯著高于惡性組(t=6.017,P ＜0.05)。見表1。

表1 2組患者胸水中LPS、IL-35、RORα水平比較 (±s)

表1 2組患者胸水中LPS、IL-35、RORα水平比較 (±s)

注:LPS為脂多糖;RORα為維甲酸相關孤兒受體α

組別例數(shù)LPS (μg/L)IL-35 (ng/L) RORα(μg/L)結核組79 2 030.17±540.32 530.47±311.52 239.11±84.45惡性組66 1 020.57±387.74 400.24±205.38 169.34±45.59 t 值2.691 2.908 6.017 P 值＜0.001 0.004 0.001

2.2 胸水LPS、IL-35、RORα水平與結核性胸膜炎的相關性 結核組賦值為1,惡性組賦值為0,進行spearman相關分析,胸水LPS水平與結核性胸膜炎呈正相關 (r =0.375,P ＜0.05);胸水IL-35水平與結核性胸膜炎呈正相關 (r=0.583,P ＜0.05);胸水RORα水平與結核性胸膜炎呈正相關(r=0.604,P ＜0.05)。

2.3 多因素logistic分析結核性胸膜炎的影響因素 以潛在危險因素變量作為自變量,結核性胸膜炎作為因變量,運用各因素平均值作為分界點分別賦值0和1 (表2),帶入logistic回歸模型中,進行多因素分析。結果顯示,胸水LPS水平升高是結核性胸膜炎的危險因素(P ＜0.05),胸水LPS水平升高者發(fā)生結核性胸膜炎的風險是胸水LPS水平正常者的4.550倍;胸水IL-35水平升高是結核性胸膜炎的危險因素 (P ＜0.05),胸水IL-35水平升高者發(fā)生結核性胸膜炎的風險是胸水IL-35水平正常者的3.720倍;胸水RORα水平升高是結核性胸膜炎的危險因素 (P ＜0.05),胸水RORα水平升高者發(fā)生結核性胸膜炎的風險是胸水RORα水平正常者的3.358倍。見表3。

表2 賦值表

2.4 胸水LPS、IL-35、RORα對結核性胸膜炎與惡性胸膜炎的鑒別診斷價值 胸水LPS對結核性胸膜炎與惡性胸膜炎的準確性明顯高于胸水RORα(P ＜0.05);胸水IL-35 對結核性胸膜炎與惡性胸膜炎的準確性明顯高于胸水LPS (P ＜0.05);胸水LPS、IL-35、RORα聯(lián)合檢測對結核性胸膜炎與惡性胸膜炎的準確性明顯高于各項指標單獨檢測(P ＜0.05)。見表4、圖1。

圖1 胸水LPS、IL-35、RORα鑒別診斷結核性胸膜炎與惡性胸膜炎的受試者工作特征曲線

3 討論

胸膜炎是呼吸系統(tǒng)常見疾病,臨床表現(xiàn)一般為咳嗽、氣急、胸悶、胸痛、呼吸困難等。胸膜炎發(fā)生的最常見原因是結核病和惡性腫瘤。結核性胸膜炎是結核分枝桿菌及其代謝產(chǎn)物、自溶產(chǎn)物入侵機體胸膜腔而引發(fā)的胸膜炎癥,屬于國家法定傳染病丙類,約占胸膜炎的30%～80%[8]。惡性胸膜炎是由癌細胞刺激胸膜所致的胸膜炎癥,約占胸膜炎的20%～60%,是肺癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤晚期的常見并發(fā)癥,惡性胸膜炎的發(fā)生提示患者癌細胞全身擴散轉移,患者的生活質量下降,患者生存時間縮短[9]。2種性質的胸膜炎給機體造成的影響不同,治療方法也有很大差別,因此準確鑒別診斷結核性胸膜炎與惡性胸膜炎有助于早期診斷、盡早治療。目前結核性胸膜炎與惡性胸膜炎主要依賴于特異性病原體的檢出或活體組織的病理學證據(jù),但胸腔積液中結核分枝桿菌含量少,涂片陽性率不足5%,培養(yǎng)耗時太長,且胸膜活檢行胸腔穿刺時具有一定創(chuàng)傷,胸腔積液采集困難,很難獲取合格標本,實驗重復性差,多數(shù)結果為非特異性表現(xiàn)[10]。因此,尋找有效檢測方法對鑒別診斷結核性胸膜炎與惡性胸膜炎有著重要的臨床指導意義。

IL-35是IL-12家族中的新成員,為一種新型具有炎癥抑制作用的細胞因子,由IL-27 的亞基EB病毒誘導蛋白3和IL-12的亞基p35共同構成。大量研究[11-13]發(fā)現(xiàn):(1)在平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞以及被炎癥介質活化后的單核細胞內(nèi)都能檢測到IL-35基因表達,EB病毒誘導蛋白3、p35在人胎盤滋養(yǎng)細胞中呈高表達,提示IL-35可能參與母體和胎兒之間的免疫耐受。 (2)IL-35 可誘導CD4+T 細胞產(chǎn)生誘導性調(diào)節(jié)性T 細胞 (induced regulatory T cell,iTreg),iTreg 又可分泌IL-35而促進產(chǎn)生更多的iTreg,從而使二者形成正反饋。(3)IL-35能夠抑制膠原誘導性關節(jié)炎大鼠局部免疫反應,緩解其關節(jié)炎癥狀,從而延緩膠原誘導性關節(jié)炎大鼠病情進展。在炎癥性腸病和自身免疫性腦脊髓炎動物模型中發(fā)現(xiàn),IL-35 能夠誘導CD4+T 細胞分化成一種新型調(diào)節(jié)性T 細胞。 (4)IL-35可通過抑制IL-17分泌,降低哮喘小鼠氣道高反應性,進而改善哮喘癥狀。IL-35可參與乙肝后肝硬化和肝纖維化免疫抑制,有望成為肝硬化新治療靶點。IL-35在鼻咽癌組織中表達水平異常高于炎性病理組織和癌旁病理組織,IL-35表達水平與鼻咽癌組織分型、局部淋巴結轉移、臨床分期關系密切。(5)IL-35可通過激活Janus激酶2/信號轉導因子和轉錄活化因子3信號通路,參與感染性疾病發(fā)生及發(fā)展。IL-35在慢性乙型肝炎患者外周血中呈高表達,且IL-35能減弱細胞毒性CD8+T細胞的殺傷力而造成病毒持續(xù)感染。(6)肺結核患者支氣管肺泡灌洗液中IL-35呈高水平。本研究顯示結核組胸水IL-35 水平顯著高于惡性組,提示IL-35可能與結核性胸腔積液有關。

LPS是革蘭陰性菌細胞壁主要成分,也是革蘭陰性菌主要致病成分,極少數(shù)存在于真菌、革蘭陽性桿菌、支原體中。LPS 通常在細菌死后其細胞壁崩解時釋放,活菌亦可以發(fā)皰形式將LPS釋放。LPS由脂質和多糖構成,能夠釋放內(nèi)源性活性因子,抑制細胞滋養(yǎng)細胞遷移,誘導血管內(nèi)皮細胞損傷,誘導機體重要臟器損傷,其生理作用是通過宿主體內(nèi)各細胞膜表面的Toll樣受體4而體現(xiàn)的。大量研究[14-16]顯示: (1)LPS能夠與細胞膜表面的Toll樣受體4 結合,將信號轉至細胞內(nèi),通過MyD88依賴性信號轉導通路,激活下游的核轉錄因子κB信號途徑和絲裂原活化蛋白激酶信號途徑,促進多種細胞因子轉錄和表達,從而促使大量炎性介質釋放; (2)LPS能夠促進血管平滑肌細胞釋放IL-8,從而趨化中性粒細胞; (3)LPS調(diào)控牙髓干細胞黏附、遷移及成脂分化,動脈外膜成纖維細胞可在LPS刺激下合成多種細胞趨化因子,如調(diào)節(jié)活化蛋白、IL-8等; (4)胸水LPS可參與肺結核局部炎癥反應以及免疫反應。本研究顯示胸水LPS在結核性胸膜炎患者中呈高水平,提示LPS可能參與了結核性胸腔積液形成。

表4 胸水LPS、IL-35、RORα對結核性胸膜炎與惡性胸膜炎的鑒別診斷價值

ROR 是孤兒核受體家族中的重要成員之一,包括RORα、RORβ、RORγ3 種亞型。RORα 是最早發(fā)現(xiàn)的亞型,廣泛表達于肝、肺、腎、大腦、胸腺、骨骼肌等多種組織中,在淋巴細胞發(fā)育、腦部發(fā)育等生理過程中具有重要調(diào)控作用,并與2型糖尿病、脂質代謝異常、自身免疫性疾病、代謝性疾病及肺癌、食管癌、肝癌等惡性腫瘤發(fā)病及病情進展密切相關。臨床已將RORα作為靶點,研發(fā)新型藥物,應用于各類疾病的治療。既往研究[17-19]顯示:(1)RORα是Th17細胞分化過程中的關鍵因子之一,RORα激動劑是臨床抗炎癥的重要方向。研究發(fā)現(xiàn),RORα在T 細胞系發(fā)育中具有重要作用,在RORα敲除狀態(tài)下,T 淋巴細胞發(fā)育受到明顯影響。(2)RORα基因多態(tài)性與哮喘易感性增加有關。(3)RORα可通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B 通路抑制胃癌細胞增殖。 (4)RORα基因敲除的小鼠對LPS誘導的肺部炎癥不易感。(5)結核性胸腔積液中RORα水平較非結核性胸腔積液顯著上升。本研究顯示胸水RORα在結核性胸膜炎患者中呈高水平,提示RORα可能參與了結核性胸腔積液形成。

本研究顯示,胸水LPS、IL-35、RORα水平升高是結核性胸膜炎的危險因素,胸水LPS、IL-35、RORα聯(lián)合檢測對結核性胸膜炎與惡性胸膜炎具有較高的鑒別診斷價值,即結核性胸膜炎患者入院時胸水RORα＞1 507.75 μg/L、LPS＞285.35μg/L、IL-35＞197.03 ng/L,則可提示結核性胸膜炎發(fā)病風險較大,臨床針對此類患者需多加關注,準確鑒別,以降低漏診、誤診率。

綜上所述,胸水LPS、IL-35、RORα在結核性胸膜炎患者中呈高水平,胸水LPS、IL-35、RORα聯(lián)合檢測在結核性胸膜炎與惡性胸膜炎的鑒別診斷中價值較高,有望在臨床上推廣。鑒于其機制不明,仍需要深入研究。

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