乳腺癌超聲彈性成像與TLR9、Her-2和ER的相關性

牡丹江醫學院附屬紅旗醫院 超聲科，黑龍江 牡丹江 157011

引言

乳腺癌被視作現代女性第一疾病，據統計，至2008年，世界范圍內乳腺癌占女性癌癥新發病例的23%，女性癌癥死亡病例的14%，已然成為現代女性健康和幸福生活的主要破壞者[1-2]。2005—2013年間我國女性乳腺癌發病率和死亡率城市均比農村高，然而農村女性乳腺癌發病率和死亡率具有更加明顯的上升趨勢[3]。因此對于乳腺癌患者而言，早期準確的診斷顯得尤為重要。乳腺超聲檢查是乳腺癌篩查的常用影像技術，其優勢為價格便宜而且無創，患者順應性高。超聲彈性成像是近年來發展的新的影像技術，可參照病灶硬度的不同確定患者乳腺腫瘤性質，所獲得的信息可作為普通超聲的重要補充。但是由于早期乳腺癌病灶不大，觸診不易觸及，聲像學特征不典型等特征，故而存在部分患者出現漏診、誤診現象[4-5]。有研究證實，Toll樣受體9（Toll-Like Receptor 9，TLR9）在乳腺癌細胞中呈高表達，并且與乳腺癌細胞的遷移侵襲有關[6-7]。人表皮生長因子受體-2（Human epidemic growth factor receptor-2，Her-2）和雌激素受體（Estrogen Receptor，ER）是評價乳腺癌預后及指導臨床治療的重要指標[8-11]。因此，本研究探討乳腺癌超聲彈性成像與TLR9、Her-2和ER表達的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集牡丹江醫學院附屬紅旗醫院門診或者住院于2017年1月至2018年12月收治的乳腺癌患者。納入標準：① 經超聲發現乳腺腫塊者；② 經超聲引導下穿刺活檢或手術切除者；③ 病理診斷明確者[12]；④ 術前未曾放療，化療或者內分泌治療者。排除標準：① 臨床資料不全或者缺失者；② 精神病患者或者不能配合檢查者；③ 由其他部位腫瘤轉移至乳腺部位者；④ 哺乳期者；⑤ 其他不符合本研究擬納入標準者。最終共納入患者176例：性別均為女性；年齡29～75歲，平均（46.96±7.83）歲；身體質量指數（Body Mass Index，BMI）21.2～26.7 kg/m2，平均（22.87±3.98）kg/m2。所有參與本研究的患者（或家屬）均知悉同意本研究，并簽署書面同意書。本研究經牡丹江醫學院附屬紅旗醫院倫理委員會批準并受其監督。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查

患者取仰臥位，雙手自然上舉，充分暴露乳房和腋窩。囑患者平靜呼吸。應用日本日立公司的EUP-L54M型彩色超聲診斷儀，探頭頻率6.0～13.0 MHz。先對雙側乳房按照乳頭-乳暈-外上-外下-內下-內上象限的順序進行二維灰階超聲檢查，記錄其特點，并根據二維特征判斷良惡性腫塊。繼而切換至彈性成像模式，先將設備調整到彈性成像感興趣區，手持探頭垂直于淋巴結作連續手動壓縮，垂直病灶方向對組織施加一定壓力，壓力指標的數字控制在3～4級，雙幅實時顯示功能，同時觀察二維圖像與彈性圖像，當病腫塊積較大時對腫塊分區域觀察。采用5分法對腫塊硬度進行評分[13]：腫塊整體或大部分顯示為綠色=1分；腫塊范圍內顯示為綠色和藍色所占比例相近，以綠色為主=2分；腫塊顯示中心為藍色，周邊為綠色=3分；病灶整體為藍色或伴有少許綠色=4分；腫塊和周邊組織均顯示為藍色，內部伴有或不伴有綠色=5分。1～3分診斷為良性，4～5分診斷為惡性。

1.2.2 TLR9、Her-2和ER表達檢測

收集患者標本，4%的多聚甲醛固定，常規脫水后用石蠟包埋，厚度4 μm連續切片，按照試劑盒（上海彩佑實業有限公司）的說明完成免疫組織化學染色。日本OLYMPUS CX31顯微鏡下選取5個高倍鏡視野（×200）計數TLR9、Her-2和ER陽性細胞所占的百分比，并進 行 評 分：5%=0分；6%～25%=1分；26%～50%=2分；51%～75%=3分；>75%為4分。Image Pro-Plus 6.0軟件測量陽性細胞染色強度，并進行評分：無色=0分；淡黃色=1分；黃色=2分；棕黃色=3分。最后將兩項相乘由此將結果分為：0～2分=“-”；3～4分=“+”；5～8分=“++”；9～12=“+++”4個等級。根據文獻資料，≥3分可診斷為惡性[14]。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件包對數據進行分析，計數資料采用例數或百分比表示。采用Spearman相關分析法進行相關性分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理結果

176例乳腺癌患者病理類型包括浸潤性導管癌、黏液腺癌、浸潤性小葉癌、原位癌、導管內癌、惡性淋巴瘤、血管肉瘤和其他等8類，其對應的患者例數（占比）分別為 92（52.27%）、11（6.25%）、23（13.07%）、13（7.39%）、18（10.23%）、9（5.11%）、7（3.98%）和3（1.70%）。

2.2 超聲征象與TLR9、Her-2和ER陽性表達的相關性

TLR9的陽性表達與腫瘤邊緣，內部回聲相關性不顯著（P＞0.05），TLR9的陽性表達與腫瘤大小、形狀、微小鈣化、血供、淋巴轉移、彈性評分顯著相關（P＜0.05）；Her-2的陽性表達與腫瘤大小，內部回聲、彈性評分相關性不顯著（P＞0.05），Her-2的陽性表達與腫瘤形狀、邊緣、微小鈣化、血供、淋巴轉移顯著相關（P＜0.05）；ER的陽性表達與腫瘤大小，內部回聲、微小鈣化、血供、彈性評分相關性不顯著（P＞0.05），ER的陽性表達與腫瘤形狀、邊緣、淋巴轉移顯著相關（P＜0.05），見表1。

表1 超聲征象與TLR9、Her-2和ER陽性表達的相關性

2.3 超聲彈性成像與TLR9、Her-2和ER陽性表達

圖1為某56歲女性乳腺癌患者超聲彈性成像的結果，腫塊其下方被藍色區域覆蓋，周邊綠色超聲彈性評分5分，病理結果為浸潤性導管癌。圖2為與圖1為同一患者的TLR9、Her-2和ER陽性表達結果：TLR9陽性表達（+++），見圖2a，Her-2陽性表達（+++），見圖2b，ER陽性表達 （+++），見圖2c。

圖1 超聲彈性成像

圖2 免疫組織化學檢測結果

3 討論

超聲彈性成像是在常規二維超聲基礎上發展而來的一種檢測技術，可以將病變的硬度以彩色色階實時呈現，通過彈性評分來判斷腫瘤的良惡性，在一定程度上彌補了常規二維超聲的不足，因乳腺癌組織較良性乳腺病變的質地硬、彈性差，故也具有良好的診斷效能[15]。超聲彈性成像能夠反映被測物體的硬度，組織異常病理狀態與組織的硬度或彈性改變相關[16]。超聲彈性成像評分差異的不同即硬度的不同與腫瘤的惡性程度呈正相關，也就是評分越高，硬度越大，惡性程度越高，反之亦然。

TLR9是Toll樣受體（Toll-Like Receptors，TLRs）家族中的一員，在配體的作用下，抗菌肽37通過調節其在核內的攝取進而使乳腺癌細胞的侵襲性增強[17]。另外，當TLR9激活后亦加強了乳腺癌細胞的遷移[18]。Her-2和ER是臨床診斷乳腺癌應用較多的生物學指標。Her-2被認為是一種有效標記惡性腫瘤侵襲性行為的生物學指標，其基因表達的具有酪氨酸激酶活性的蛋白在細胞信號的轉導中起著重要作用，主要參與了調節細胞的生長及分化，促進細胞的分裂及增殖，其中最重要的是通過增加血管內皮生長因子的產生而導致的新生血管生成[19]。Her-2的表達與乳腺癌的發生發展密切相關，可為惡性程度和轉移提供參考，并且可作為乳腺癌診斷和評估的獨立危險因素[20]。ER是核受體，其主要配體是17-β-雌二醇，作為配體依賴性轉錄因子來調節涉及乳腺癌細胞增殖、存活、侵襲和腫瘤新生血管形成的下游基因[21]。ER的陽性表達被認為是乳腺癌分化和評估預后的理想標志物[22]。

增殖是腫瘤最基本的特性之一，腫塊直徑>2 cm說明腫塊體積較大，臨床分期較晚，惡性程度高。本研究表明，腫塊較大患者TLR9和ER陽性表達較高，此結果與文獻報道結果相一致[23-24]。然而腫塊的大小可能與診斷發現的時間早晚有關，故僅以腫塊的大小不能直接判斷TLR9和ER陽性表達。腫塊形態是否規則被視為判斷乳腺病變良、惡性的常規指標。腫塊外形不規則TLR9、ER陽性率高，外形規則組TLR9、ER陰性率高，即TLR9、ER陽性者多表現為外形不規則，TLR9、ER陰性者多表現為外形規則[25-26]；外形不規則Her-2陽性率高，即高惡性腫塊外形多呈不規則改變，預示腫塊侵襲性強，兩者生物學行為一致[27]。本研究中，外形不規則患者TLR9、Her-2、ER陽性表達顯著高于規則患者。邊緣“毛刺征”是由乳腺癌細胞侵入周圍組織引起的星狀畸變，它的存在是描述惡性腫瘤的重要線索，同時也是乳腺癌的象征性表現，即有邊緣“毛刺征”結節的Her-2、ER陽性率大于無邊緣“毛刺征”者，“毛刺征”與Her-2、ER陽性表達有關[28-30]。本研究腫塊“毛刺征”組中，Her-2、ER陽性表達高，兩者存在潛在聯系，生物學行為一致。乳腺癌的鈣化通常是微小鈣化，主要是由組織引起的腫瘤的變性，壞死和鈣鹽的沉淀[31]。在本研究中，TLR9、Her-2陽性表達與微小鈣化顯著相關，表明腫瘤惡性程度增加，隨著鈣化，腫瘤會侵襲而且患者的預后很差。腫瘤血液供應，作為一種腫瘤形態變化的重要標志，對于腫瘤的發展很重要，所以檢測血液供應有利于判斷腫瘤侵襲和預后。在本研究中，TLR9、Her-2的陽性表達與血供相關。淋巴結轉移在超聲彈性成像表現為低回聲，如若患者發生轉移提示腫瘤惡性增強[32]。研究表明，乳腺癌轉移灶中TLR9、Her-2、ER呈高表達[33-35]。在本研究中，TLR9、Her-2、ER陽性表達與淋巴轉移呈正相關。淋巴結轉移時，參考TLR9、Her-2、ER高表達提示腫瘤侵襲性與轉移性強。通常認為，乳腺內組織的彈性系數與組織的硬度成正比，浸潤性導管癌硬度較高，本研究中大部分為浸潤性導管癌，占52.27%。TLR9表達越高，腫瘤細胞增殖率越高，臨床分期高，易出現侵襲，與周圍組織粘連致腫塊彈性減小、硬度增加[36]。本研究中，彈性成像高評分組TLR9具高表達率。腫塊質地越硬，腫瘤惡性程度高，這與TLR9高表達提示腫瘤侵襲性高度吻合[17]。

綜上所述，乳腺癌超聲特征與TLR9、Her-2、ER陽性表達有一定的相關性，聯合檢測可提高乳腺癌診斷的準確性。本研究的局限之處在于：樣本量較少、檢測時間點單一、無連續多時間觀察。在本研究的后續研究中，將會增加樣本量及多時間點檢測，進一步確保結果的準確性。