血清miR-144及miR-203表達(dá)水平對胃癌診斷及預(yù)后評估的價值

趙高傳 陳卿奇 龐 莉 程 正

(海南洋浦經(jīng)濟(jì)開發(fā)醫(yī)院消化內(nèi)科,洋浦 578101)

胃癌是胃黏膜上皮的常見消化道惡性腫瘤，其致死率高居癌癥相關(guān)死因的第2位，已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一[1]。目前，根治性切除術(shù)是治療胃癌的主要手段之一，但仍有部分患者手術(shù)療效欠佳，術(shù)后5年生存率較低。因此，早期預(yù)判胃癌患者的預(yù)后情況并及時進(jìn)行干預(yù)對提高患者的生存率具有重要意義。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類長度在21～25 nt的非編碼小分子RNA，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和新陳代謝等過程，在胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-144及miR-203在胃腸道腫瘤患者中異常表達(dá)，并能通過調(diào)控多種信號通路參與胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可能在胃腸道腫瘤的診斷、治療和預(yù)后方面扮演重要角色[3-4]。然而，關(guān)于血清miR-144及miR-203表達(dá)水平對胃癌診斷及預(yù)后評估的研究鮮有報道。本研究通過檢測胃癌患者術(shù)前血清miR-144及miR-203表達(dá)水平，分析其對胃癌診斷及預(yù)后評估的價值，旨在為胃癌的診斷及靶向治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料 選取2015年1月1日至2017年12月31日海南洋浦經(jīng)濟(jì)開發(fā)醫(yī)院和海南西部中心醫(yī)院行胃癌根治術(shù)治療的胃癌患者106例，其中男74例，女32例，年齡36～82歲，中位年齡61.70歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)胃鏡檢查及組織病理學(xué)結(jié)果診斷為胃癌，參照WHO胃癌的病理學(xué)分類；②胃癌患者均常規(guī)行標(biāo)準(zhǔn)胃癌根治術(shù)治療(D2術(shù)式)，即胃大部分或全胃切除加清除胃周第二站淋巴結(jié)，術(shù)后根據(jù)患者情況行輔助化療；③能配合本次研究及病歷資料完整者。排除合并其他惡性腫瘤，無法配合本次研究者。另選取同期45例體檢健康對照組，其中男30例，女15例，年齡35～79歲，中位年齡60.80歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1研究方法 采用前瞻性研究方法對106例胃癌患者進(jìn)行隨訪，患者術(shù)后最初2年每3個月返院隨訪1次，以后每6個月1次，由專職人員采用電話或門診等方式對患者或家屬進(jìn)行隨訪，截止時間為2019年5月31日。總生存時間(overall survival,OS)定義為術(shù)后第1天至患者死亡的時間。無進(jìn)展生存時間(progression-free survival,PFS)定義為術(shù)后第1天起，未發(fā)生復(fù)發(fā)、原發(fā)器官腫瘤轉(zhuǎn)移及其他原因引起死亡的時間。納入本研究的變量包括患者年齡、性別、臨床癥狀、TNM分期、分化程度、侵犯深度、脈管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移等情況。

1.2.2miR-144及miR-203檢測 miR-144引物：上游：5′-ACTAGATGCTACTAGCAGACG-3′，下游：5′-GATCAGTAGTGAGACTAG-3′；miR-203引物：上游：5′-GCATGCAGTATGTCTATCAG-3′，下游：5′-ACTAGACTAGATAGTCAG-3′。所有患者均于術(shù)前抽取空腹靜脈血5 ml置于未加抗凝劑的離心管中，3 500 r/min 離心10 min，吸取上層血清400 μl，加入1 ml提取劑(TRIzol)，于-70℃保存。在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系為20 μl：TaqMan MicroRNA Assay 1.00 μl，cDNA 1.33 μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μl，ddH2O 7.67 μl，混合后離心放入定量PCR儀。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃復(fù)性60 s進(jìn)行45個循環(huán)，實驗重復(fù)3次。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-144及miR-203的相對表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

2 結(jié)果

2.1胃癌組和對照組血清miR-144及miR-203表達(dá)水平比較 胃癌組血清miR-144表達(dá)水平(0.23±0.05)明顯低于對照組(1.17±0.60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.627，P<0.001)；胃癌組血清miR-203表達(dá)水平(0.38±0.12)明顯低于對照組(1.05±0.46)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.215，P<0.001)。見圖1。

圖1 胃癌組和對照組血清miR-144及miR-203表達(dá)水平比較

2.2血清miR-144及miR-203表達(dá)水平診斷胃癌的價值 血清miR-144表達(dá)水平診斷胃癌的最佳截斷值為0.53，曲線下面積(area under cure，AUC)為0.856(95%CI：0.797～0.917)，其敏感度和特異度為86.2%和82.7%。血清miR-203表達(dá)水平診斷胃癌的最佳截斷值為0.62，AUC為0.814(95%CI：0.753～0.875)，其敏感度和特異度為82.0%和78.0%。見圖2。

圖2 血清miR-144及miR-203表達(dá)水平診斷胃癌的ROC曲線

2.3血清miR-144及miR-203表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理特征比較 以miR-144=0.53及miR-203=0.62為界值，將106例胃癌患者分為高miR-144組(miR-144≥0.53，n=30)和低miR-144組(miR-144<0.53，n=76)；高miR-203組(miR-203≥0.62，n=35)和低miR-203組(miR-203<0.62，n=71)。高miR-144組與低miR-144組的TNM分期、脈管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高miR-203組與低miR-203組的TNM分期、脈管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組的年齡、性別、飲酒史、分化程度、侵犯深度及腫瘤最大徑比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 血清miR-144及miR-203表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理特征比較[n(%)]

2.4miR-144及miR-203表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良的關(guān)系 106例胃癌患者中失訪4例，隨訪率為96.2%(102/106)，隨訪時間為8～58個月，中位隨訪時間為29個月。生存分析顯示，低miR-144組患者總生存率明顯低于高miR-144組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(31.7% vs 60.4%；Log-rankχ2=15.370，P<0.001)；低miR-144組患者無進(jìn)展生存率明顯低于高miR-144組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(19.6% vs 42.8%；Log-rankχ2=11.206，P<0.001)，見圖3。低miR-203組患者總生存率明顯低于高miR-203組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(34.0% vs 58.2%；Log-rankχ2=12.183，P<0.001)；低miR-203組患者無進(jìn)展生存率明顯低于高miR-203組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(22.5% vs 39.7%；Log-rankχ2=9.512，P<0.001)，見圖4。對單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的因素(TNM分期、脈管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、miR-144及miR-203)調(diào)入COX回歸分析模型，結(jié)果顯示腹膜轉(zhuǎn)移[HR(95%CI)=3.164(2.273～6.108)]、肝轉(zhuǎn)移[HR(95%CI)=1.905(1.217～4.106)]、miR-144<0.53[HR(95%CI)=2.730(1.981～5.394)]及miR-203<0.62[HR(95%CI)=2.181(1.562～4.775)]是影響胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

圖3 高miR-144組與低miR-144組胃癌患者總生存時間及無進(jìn)展生存時間曲線比較

圖4 高miR-203組與低miR-203組胃癌患者總生存時間及無進(jìn)展生存時間曲線比較

表2 影響胃癌患者預(yù)后不良的單因素及多因素COX回歸分析

3 討論

胃癌根治術(shù)是指原發(fā)腫瘤連同轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及受累浸潤的組織一并被切除的手術(shù)，并最大限度的保證腫瘤的徹底切除，減少局部的復(fù)發(fā)，從而達(dá)到治愈的效果[5]。然而，部分晚期患者的預(yù)后難以被準(zhǔn)確地評估，其術(shù)后死亡率較高。因此，尋找用于胃癌個體化治療和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物具有重要意義。miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化等過程，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，有望成為腫瘤診斷和治療的重要靶點[6]。近期的研究表明，miR-144及miR-203在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且不同惡性腫瘤中miR-144及miR-203的表達(dá)水平不同，miR-144及miR-203對惡性腫瘤的診斷、轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷等方面具有重要的價值[7-8]。

本研究顯示，胃癌組血清miR-144及miR-203表達(dá)水平均明顯低于對照組，提示血清miR-144及miR-203表達(dá)水平在胃癌患者中異常低表達(dá)，其可能通過發(fā)揮抑癌基因的作用來調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。MUSHTAQ等[9]研究顯示，與正常胃上皮細(xì)胞相比，miR-144在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，miR-144的過度表達(dá)抑制了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其在胃癌進(jìn)展中起重要作用。LI等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-203在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，有可能在胃癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中隨著TNM分期增加、脈管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移的胃癌患者，miR-144及miR-203的表達(dá)水平均下調(diào)，提示miR-144及miR-203低表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的進(jìn)展過程，其低表達(dá)可導(dǎo)致一系列其靶向的癌基因過度激活，從而參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。REN等[11]研究顯示，miR-144在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM期顯著相關(guān)，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。ZHOU等[12]研究認(rèn)為，miR-203在胃癌組織和細(xì)胞中顯著下調(diào)，miR-203的高表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞的集落形成、遷移和侵襲，其可能是一種新的胃癌治療策略。另有研究表明，miRNA在胃癌患者中明顯升高，其可能參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展，其差異表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是影響胃癌患者總生存率的獨立預(yù)后因素[13]。

本研究應(yīng)用ROC曲線分析，結(jié)果顯示血清miR-144及miR-203表達(dá)水平診斷胃癌的最佳截斷值分別為0.53、0.62，以此為標(biāo)準(zhǔn)對胃癌患者進(jìn)行分組，并分析miR-144及miR-203表達(dá)水平與胃癌患者生存時間之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，低miR-144及miR-203組患者總生存率低于高miR-144及miR-203組，低miR-144及miR-203組患者無病生存率低于高miR-144及miR-203組。這說明miR-144及miR-203低表達(dá)與胃癌患者生存期短有關(guān)。此外，本研究進(jìn)一步采用單因素及多因素COX回歸模型分析顯示，腹膜轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、miR-144<0.53及miR-203<0.62是影響胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素。LIU等[14]研究顯示，miR-144在胃癌組織和血清中的表達(dá)明顯下調(diào)，miR-144水平較低的患者5年總生存率和無病生存率較差，可作為胃癌診斷及預(yù)后預(yù)測的潛在生物標(biāo)志物。ZHENG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-203的表達(dá)明顯低于非癌組織，miR-203的低表達(dá)對總生存率和無進(jìn)展生存率有顯著影響，是影響總生存率(HR=2.73，95%CI：1.69～8.91，P=0.01)和無進(jìn)展生存率(HR=4.19，95%CI：2.91～10.12，P=0.005)的獨立預(yù)后因素。另有研究表明，血清miR-203的低表達(dá)與無病生存率和總生存率顯著相關(guān)，多因素分析顯示miR-203低表達(dá)、腹膜和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是胃癌預(yù)后不良的獨立預(yù)測指標(biāo)，有望作為胃癌患者預(yù)后預(yù)測的無創(chuàng)生物標(biāo)志物[16]。

綜上所述，胃癌患者血清miR-144及miR-203表達(dá)水平下調(diào)，腹膜轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、miR-144<0.53及miR-203<0.62是影響胃癌患者預(yù)后不良的獨立危險因素，其中miR-144及miR-203低表達(dá)與胃癌患者生存期短有關(guān)，可能是預(yù)測胃癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。但本研究為單中心研究，病例來源較單一，缺乏多中心的研究結(jié)果，未來仍需大規(guī)模多中心的前瞻性研究進(jìn)一步證實miR-144及miR-203與胃癌患者預(yù)后不良的關(guān)系。