初治系統性紅斑狼瘡患者外周血中NK細胞的變化及臨床意義①

邢 雪 袁啟航 葉小康 李 霞 陸智敏

(大連醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，大連 116044)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以多種淋巴細胞異常活化和多器官受累為特征的自身免疫性疾病[1]。免疫學家一直致力于適應性免疫細胞(包括T細胞和B細胞)在SLE發病中的機制研究，關于天然免疫核心細胞自然殺傷細胞(natural killer，NK)的研究仍較少[2]。NK細胞占外周血淋巴細胞總數的5%～20%，在抗感染免疫、腫瘤免疫及免疫調節中發揮重要作用，是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁[3-4]。目前多數研究提示NK細胞在SLE中數量異常，但機制尚不清楚[4-6]。且糖皮質激素及免疫抑制劑本身也會影響NK細胞數量及功能，為了進一步探究NK細胞在SLE中的變化及作用，本文將分析初治SLE患者(未使用糖皮質激素及免疫抑制劑)外周血中NK細胞的變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1病例選擇 該研究為橫斷面研究。選取2018年1月至2018年12月于南通大學附屬醫院就診的初治SLE患者(未使用糖皮質激素及免疫抑制劑)42例，均符合美國風濕病學會(ACR)1997年修訂的SLE分類診斷標準，排除感染、腫瘤及其他自身免疫病[7]。疾病活動評分采用系統性紅斑狼瘡疾病活動評分(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[8]。其中女性38例，男性4例，平均年齡(37.1±14.1)歲；另選正常對照組25例，其中女性22例，男性3例，平均年齡(32.3±8.9)歲，均來自南通大學附屬醫院體檢中心的健康人群，無風濕病史和風濕病家族史。各組年齡、性別差異比較均無統計學意義。狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)定義為24 h尿蛋白大于0.5 g或尿沉渣(WBC>5/HP or RBC >5/HP)或腎活檢證實。42例SLE患者LN組18例，無LN組24例。本研究取得所有受試者的知情同意并獲得南通大學附屬醫院倫理委員會批準(批件號：2016-041)。

1.1.2主要試劑與儀器 FITC-conjugated anti-CD3及 PE-conjugated anti-CD56 購于美國BD公司；鼠抗人 FITC-and PE-conjugated IgG1 作為同型對照；人淋巴細胞分離液購于中國醫學科學院生物工程研究所。FACSCalibur型流式細胞儀購于美國BD公司；流式分析軟件為FCS ExpressV3(De Novo Software，Canada)。

1.2方法

1.2.1標本采集 采集肝素抗凝外周血4 ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，800 g離心30 min，計數。

1.2.2NK細胞數量的檢測 PBMC經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，調整細胞濃度為2×106個/ml，加入FITC-CD3、PE-CD56，對照管加相應的同型對照，常溫避光20 min，1 ml PBS洗滌。分析CD3-CD56+細胞占百分率并計算絕對數。

1.2.3臨床指標的檢測 白細胞(white blood cell，WBC)、血紅蛋白(blood hemoglobin，Hb)、血小板(blood platelet，PLT)、血沉(erythrocyte sedimentation rate ,ESR)、C反應蛋白(serum levels of C-reactive protein,CRP)、補體C3、補體C4、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、抗dsDNA抗體、抗核抗體(ANA)、24 h尿蛋白定量常規檢測。

2 結果

2.1初治SLE患者臨床資料 42例初治SLE患者基本臨床資料見表1。平均年齡為(37.1±14.1)歲，女性38例，男性4例，病程(36.1±57.9)個月。SLEDAI評分為(10.52±4.96)分。

表1 初治SLE患者臨床資料

2.2初治SLE患者外周血中NK細胞變化 初治SLE患者外周血中NK細胞占淋巴細胞百分率為(5.8±3.8)%，低于正常對照組的(13.4±4.9)%(P<0.01)。與正常對照組相比，SLE患者外周血中NK細胞絕對數顯著下降[(267.9±111.9)個/μl vs(60.3±46.2)個/μl](P<0.01)。初治SLE患者SLEDAI評分為10.52±4.96。根據SLEDAI評分分為不活動5例(0～4分)，輕度活動12例(5～10分)，中重度活動25例(大于10分)。與不活動組相比，中重度活動組NK細胞絕對數顯著下降[(49±34)個/μl vs(108±51)個/μl](P<0.01)。見圖1。

圖1 初治SLE患者外周血中NK細胞變化

2.3SLE患者外周血中NK細胞數量與臨床指標的相關性分析 NK細胞絕對數與SLEDAI評分呈負相關(r=-0.365，P=0.018)。SLE患者外周血PLT計數為(188.4±92.0)×109個/L，補體C3(0.49±0.24)g/L。PLT(r=0.343，P=0.026)及補體C3(r=0.445，P=0.003)均與NK細胞絕對數呈正相關。抗dsDNA抗體滴度與NK細胞絕對數有負相關趨勢(r=-0.263，P=0.093)，見圖2。NK細胞數量與血清補體C4、ESR、CRP、免疫球蛋白均無顯著相關性。

圖2 初治SLE患者外周血中NK細胞絕對數與疾病活動度相關性分析

2.4LN組NK細胞數量顯著減少 LN組外周血NK細胞絕對數明顯低于無LN組(43.8±48.9 vs 72.6±40.8，P<0.05)，差異有統計學意義。兩組NK百分率無統計學差異(4.9±3.7% vs 6.4±3.9%，P=0.238)。見圖3。

圖3 LN患者外周血中NK細胞變化

3 討論

SLE是自身免疫病的原型疾病，好發于育齡期女性，全身各臟器均可受累；以自身DNA及RNA大量釋放及淋巴細胞活化產生多種自身抗體為特征[1]。近年來，早期發現、規范治療使SLE患者生存期延長，而感染成為SLE最常見的死亡原因[9-10]。與獲得性免疫缺陷病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)患者類似，SLE患者也是各種機會性感染(尤其病毒感染)的好發人群。此外，感染也是SLE患者疾病復發的主要因素之一。目前較公認的觀點是藥物使用及自身免疫功能異常均參與了SLE患者易感染及感染不易控制，但其機制尚未完全明確。

NK細胞是經典的固有免疫細胞，能迅速殺傷靶細胞(如病毒感染的宿主細胞)，且無MHC限制性，在機體抗感染免疫應答的早期發揮重要作用。同時NK細胞還具有強大的細胞因子分泌功能，不僅調節固有免疫應答，而且參與調節獲得性免疫應答，是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁[3-4]。

目前多數研究均提示SLE患者外周血中NK細胞顯著減少[4-6,11-13]。由于糖皮質激素、免疫抑制劑會影響NK細胞的數量，本研究納入初發SLE患者(未使用糖皮質激素及免疫抑制劑)，同樣證實NK細胞絕對數及百分率均明顯下降，其中以絕對數顯著下降，不到正常人的四分之一，提示NK細胞在狼瘡疾病發生發展中發揮重要作用。

NK細胞表面活化性受體和抑制性受體處于動態平衡，對維持該細胞的功能發揮重要作用。關于各型受體在SLE患者外周血變化的研究尚存在爭議。HUANG等[13]發現抑制性受體CD158b 分子及活化受體CD16、CD226在SLE患者NK細胞上的表達均下降，其他抑制劑受體(NKG2A、CD94 和 CD85j)及活化性受體(NKG2D、NKp46 和 CD69)沒有差異。在部分活動期患者中藥物治療可有效恢復 CD226+NK細胞比例。HERVIER等[12]研究證實SLE患者外周血中NK細胞的細胞毒作用下降，分泌IFN-γ增多，其表面CD69和NKG2A表達增多，CD16和KIR(the killer cell immunoglobulin-like receptor)KIR2DL1/KIR2DS1表達減少。一項來自臺灣研究證實SLE患者體內NK細胞對IL-15反應減低，殺傷能力下降[14]。BANCHEREAU等[15]對于SLE患者全血指紋測序研究提示，SLE患者體內NK細胞的細胞毒性作用顯著減少。既往研究證實與正常組相比，SLE患者NK細胞表達穿孔素減少，表達顆粒酶B平均熒光強度增加，分泌IFN-γ增多；IL-15可以增強NK細胞IFN-γ/TNF-α分泌、穿孔素/顆粒酶以及CD107a脫顆粒表達[6]。以上關于NK細胞表型的研究尚有爭議，其在SLE患者中表型的變化需要更大樣本量的研究。

NK細胞的功能狀態是各型表面分子綜合作用的結果，不能單純的用活化和抑制來反映。不同藥物的治療及人群的選擇可能導致結果的差異，提示無糖皮質激素及免疫抑制劑治療患者的結果更能反映SLE患者體內NK細胞的真實狀態。研究證實SLE患者體內IFN-a導致NK細胞活化后凋亡增加，從而導致數量減少。該研究團隊同時發現CD226+NK細胞浸潤至狼瘡鼠的腎臟，并通過分泌細胞毒性顆粒和細胞因子發揮致病作用[13,16]。且LN患者腎臟組織病理中NK細胞表面活化受體NKG2D的配體MICA顯著增多[16]。本研究證實LN患者外周血NK細胞顯著低于無LN的SLE患者，推測NK可能通過趨化至局部發揮重要致病作用，進而導致外周血中數量的下降，具體機制有待進一步研究。

SEGERBERG等[17]研究提示抗KIR陽性SLE患者體內的IgG在體外可降低NK細胞對K562細胞的殺傷能力。近期研究發現部分活動性SLE患者外周血中存在抗CD94/NKG2A抗體和抗 CD94/NKG2C 抗體，該抗體可減少NK細胞某些亞群的數量及功能，在SLE疾病中發揮重要作用[18]。HANAOKA等[19]研究證實SLE患者體內NK細胞中的NKG2D可通過Caspase通路導致CD3ζ 信號傳導異常，在自身免疫病中發揮重要作用。哈佛大學研究團隊證實CD3ζ水平與NK細胞毒性作用相關，且NK細胞CD3ζ表達下調導致SLE患者NK細胞炎癥表型[20]。

此外有研究證實SLE患者外周血中NK細胞表達CD80、CD86及HLA-DR增高，可以調節DC細胞功能，進而在SLE疾病中發揮調節性功能。同時NK細胞可通過殺傷 iDCs抑制適應性免疫應答，并影響T細胞功能，推測其數量的減少可能導致適應性免疫異常加劇，雙鏈DNA抗體增加，患者疾病活動度增加，具體機制還有待進一步研究[21]。

本研究證實NK細胞減少與疾病活動評分、補體C3及抗dsDNA抗體顯著相關，提示NK細胞功能異常參與狼瘡疾病發生發展有關。補體可以通過DC細胞調節NK細胞的功能，推測低補體血癥時，NK細胞接受DC細胞的初始刺激異常，可能導致細胞數量及功能異常，具體機制還有待進一步研究[22]。且NK細胞為一線的抗感染細胞，其數量顯著減少可能與SLE患者容易發生機會性感染相關，推測調節NK細胞的數量及功能對控制狼瘡機會性感染及改善SLE預后有重要意義。

SLE中NK細胞存在數量及功能的異常，其在固有免疫及適應性免疫之間所起作用及機制充滿未知。對NK細胞在SLE發病機制中進行更深入研究可能會開創SLE新的治療策略。