LncRNA TMPO-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-204-3p影響肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲

鄧俊亮 華美香 陳鍵騰

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬新會(huì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江門 529100)

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，是全球范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)死亡的主要原因。根據(jù)肺癌的分化程度和形態(tài)特征，其可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，在所有肺癌患者中，有85%是非小細(xì)胞肺癌[1]。大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者表現(xiàn)為局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病，可選擇的治療方式有限，導(dǎo)致患者的5年總生存率較低[2]。因此，了解非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療對(duì)提高患者生存率具有重要意義。越來(lái)越多的證據(jù)表明，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展涉及許多分子變化，例如由表觀遺傳調(diào)控誘導(dǎo)的基因表達(dá)的改變[3-4]。近年來(lái)，已有研究證明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)直接參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程[5]。胸腺生成素反義轉(zhuǎn)錄本1(thymopoietin antisense transcript 1，TMPO-AS1)是一種與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)程密切相關(guān)的lncRNA[6]。ZHENG等[7]分析了來(lái)自癌基因組圖譜的肺腺癌患者的lncRNA表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)顯示，TMPO-AS1在肺腺癌患者中呈高表達(dá)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)。PENG等[8]的研究同樣顯示，TMPO-AS1可能是肺腺癌預(yù)后的標(biāo)志分子。然而，目前未見TMPO-AS1在肺癌中的作用及可能機(jī)制的研究。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TMPO-AS1和miR-204-3p間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，但TMPO-AS1和miR-204-3p是否存在靶向關(guān)系調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)探究TMPO-AS1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響及對(duì)miR-204-3p的靶向關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975、H1299和H1650和人正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE(美國(guó)ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、MTT試劑(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素混合液(美國(guó)Abcam公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Intvitrogen公司)；TMPO-AS1 siRNA及陰性對(duì)照siRNA control(上海吉?jiǎng)P制藥技術(shù)有限公司)；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)；SYBR Green PCR Master Mix檢測(cè)試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut熒光素酶重組載體質(zhì)粒(上海生工生物工程有限公司)；熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)；TMPO-AS1過(guò)表達(dá)重組載體質(zhì)粒及空載質(zhì)粒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)；PCNA、Ki-67、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、MMP-2和MMP-9單抗及HRP標(biāo)記的二抗(英國(guó)Abcam公司)；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(日本TaKaRa公司)；Transwell小室(美國(guó)Coring公司)；細(xì)胞裂解液、BCA試劑盒、超敏ECL發(fā)光試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)A549、H1975、H1299、H1650和HBE細(xì)胞，放置在37℃、飽和濕度、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2 d換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率至80%以上時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取指數(shù)增殖期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肺癌A549細(xì)胞接種到6孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%時(shí)，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將TMPO-AS1 siRNA或陰性對(duì)照siRNA control轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書。將轉(zhuǎn)染TMPO-AS1 siRNA的A549細(xì)胞命名為si-TMPO-AS1組，轉(zhuǎn)染siRNA control的A549細(xì)胞命名為si-NC組，轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體的A549細(xì)胞命名為Control組，三組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h行qPCR檢測(cè)。

1.2.3qPCR檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、H1975、H1299、H1650和HBE細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染48 h三組A549細(xì)胞，使用Trizol試劑分別抽提總RNA，純化RNA，并使用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的純度和豐度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix檢測(cè)試劑盒行qPCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：cDNA 2 μl、2×SYBR Green Mix 10 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、ddH2O 6 μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；隨后95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 10 s循環(huán)40次。以GADPH為內(nèi)參檢測(cè)細(xì)胞中TMPO-AS1的表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參檢測(cè)細(xì)胞中miR-204-3p的表達(dá)水平。所用引物序列：TMPO-AS1正向引物：5′-TCAAACCCGTATTACCGATCCA-3′，反向引物：5′-ACCCTACATCCAAGGTCTCCT-3′；GADPH正向引物：5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，反向引物：5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′；miR-204-3p正向引物：5′-CGCTCGAGCCTTCTTCCTTGCCTCTCA-3′；反向引物5′-CAGCGGCCGCGTAAAATTTGACATGGAC-3′。U6正向引物：5′-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3′；反向引物：5′-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3′。反應(yīng)結(jié)束后分別獲得目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 在線生物信息學(xué)軟件LncBase Experimental v.2預(yù)測(cè)TMPO-AS1在miR-204-3p上的結(jié)合位點(diǎn)。依據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果擴(kuò)增miR-204-3p上含有及突變的TMPO-AS1結(jié)合位點(diǎn)的片段，并插入到熒光素酶報(bào)告載體上(分別為miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut熒光素酶重組載體質(zhì)粒)，該部分由上海生工生物工程有限公司完成。用miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut分別與TMPO-AS1過(guò)表達(dá)重組載體質(zhì)粒或空載質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，根據(jù)熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定熒光素酶活性，計(jì)算各組細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5MTT檢測(cè) 對(duì)數(shù)期的A549細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞匯合率至50%時(shí)按照1.2.2進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Control組、si-NC組和si-TMPO-AS1組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，向每孔細(xì)胞加入20 μl MTT溶液，隨后放置在37℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸取細(xì)胞上清液，再加入150 μl二甲基亞砜，充分混勻后放置到振蕩儀上反應(yīng)10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值(A值)，分別計(jì)算三組A549細(xì)胞活性，細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) A549細(xì)胞按照1.2.2轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集三組細(xì)胞約1×105個(gè)，向細(xì)胞中加入Binding Buffer緩沖液500 μl重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將500 μl細(xì)胞懸液加入流式管中，再分別向流式管中加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI染液，混勻后于室溫下避光反應(yīng)15 min，在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析三組A549細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后三組A549細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，饑餓處理24 h，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)/ml，取200 μl細(xì)胞懸液接種到Matrigel膠預(yù)先包被的Transwell小室的上室，在小室下層添加500 μl含10%血清的培養(yǎng)液，放置在37℃常規(guī)培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育48 h。取出小室，用濕潤(rùn)的棉簽擦去上層未穿過(guò)基底膜的細(xì)胞，用多聚甲醛固，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)三組A549細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)目。

1.2.8Western blot檢測(cè) 使用細(xì)胞裂解液分別提取轉(zhuǎn)染48 h三組A549細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行濃度測(cè)定并調(diào)平。配制10%的SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白上樣，電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。實(shí)驗(yàn)5%脫脂奶粉室溫封阻2 h，洗膜并加入相應(yīng)一抗，根據(jù)說(shuō)明書將PCNA和Ki-67一抗1∶500稀釋，Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9一抗1∶600稀釋，MMP-2和MMP-9一抗1∶800稀釋，4℃過(guò)夜孵育。第2天洗膜后再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1.5 h，洗膜后滴加超敏ECL顯色液，在暗室顯影曝光，采集圖像，使用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1TMPO-AS1在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá) qPCR結(jié)果顯示，與人正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE比較，人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1975、H1299和H1650中TMPO-AS1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表1。在肺癌細(xì)胞系中A549細(xì)胞中TMPO-AS1的表達(dá)水平最高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選其為研究對(duì)象。

表1 TMPO-AS1在HBE細(xì)胞系和不同肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2TMPO-AS1對(duì)miR-204-3p表達(dá)的影響 qPCR結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細(xì)胞TMPO-AS1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-204-3p的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組中TMPO-AS1和miR-204-3p的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組A549細(xì)胞中TMPO-AS1和miR-204-3p的表達(dá)比較

2.3TMPO-AS1靶向結(jié)合miR-204-3p 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，TMPO-AS1與miR-204-3p序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明TMPO-AS1和miR-204-3p可能存在靶向關(guān)系。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TMPO-AS1能夠明顯降低野生型miR-204-3p細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性(P<0.05)，對(duì)突變型miR-204-3p細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)。見圖1。

圖1 TMPO-AS1靶向miR-204-3p

2.4沉默TMPO-AS1對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白PCNA和Ki-67的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細(xì)胞中PCNA和Ki-67的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表3。

表3 三組A549細(xì)胞活性及PCNA和Ki-67的表達(dá)水平比較

圖2 Western blot檢測(cè)三組A549細(xì)胞中PCNA和Ki-67蛋白的表達(dá)

2.5沉默TMPO-AS1對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3和表4。

表4 三組A549細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)水平比較

圖3 沉默TMPO-AS1對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

2.6沉默TMPO-AS1對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯下降(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細(xì)胞侵襲數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-TMPO-AS1組A549細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與Control組相比，si-NC組A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4和表5所示。

表5 三組A549細(xì)胞穿膜數(shù)目及MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平比較

圖4 沉默TMPO-AS1對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，在男性中發(fā)病率更高，也是我國(guó)常見的惡性腫瘤[9]。近來(lái)，盡管在非小細(xì)胞肺癌的臨床治療方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是患者的總生存時(shí)間并沒(méi)有顯著改善，并且一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題是缺乏有價(jià)值的生物分子標(biāo)志物[10]。因此，迫切需要了解非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以改善疾病發(fā)作時(shí)的診斷和有效治療。lncRNA作為一種非蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本，通常被定義為長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，最近引起了越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA可能在多種癌癥的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并作為包括預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在治療靶標(biāo)在內(nèi)的許多臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)[11-12]。最近有報(bào)道顯示，lncRNA的異常表達(dá)可能與表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)，并參與了癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[13]。TMPO-AS1作為TMPO反義轉(zhuǎn)錄本1，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的增殖過(guò)程。目前有證據(jù)表明，TMPO-AS1在人類惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。如TMPO-AS1在前列腺癌中過(guò)度表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，且被認(rèn)為是前列腺癌預(yù)后不良的標(biāo)志物[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TMPO-AS1在人肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于人正常支氣管上皮細(xì)胞系，這提示TMPO-AS1可能在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮致癌基因的作用。選取TMPO-AS1表達(dá)量最高的肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)染TMPO-AS1 siRNA沉默其表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默TMPO-AS1后A549細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著降低，增殖相關(guān)蛋白PCNA和Ki-67的表達(dá)明顯下調(diào)，凋亡率明顯升高，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)明顯上調(diào)，表明TMPO-AS1在肺癌中發(fā)揮促癌的作用。這與以往QIN等[15]關(guān)于TMPO-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)其自然反義轉(zhuǎn)錄物TMPO促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展的研究相符。

研究顯示，微小RNA(microRNA，miRNA)可以調(diào)節(jié)各種生物學(xué)過(guò)程，并在癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。有趣的是，在包括癌癥在內(nèi)的許多疾病中都發(fā)現(xiàn)了miRNA和lncRNA之間的交叉調(diào)控。miRNA可以靶向lncRNA以降低lncRNA的穩(wěn)定性，而lncRNA也可以充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)來(lái)拮抗miRNA或lncRNA[17]。已發(fā)現(xiàn)miR-204-3p在幾種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，例如胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和卵巢癌，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18-20]。在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中具有較高miR-204-3p表達(dá)的患者的總生存期則明顯更高，ERβ通過(guò)改變ERβ/circATP2B1/miR-204-3p/FN1信號(hào)軸來(lái)促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲[21]。一項(xiàng)研究顯示，miR-204-3p在頭頸部腫瘤中作為抑癌基因發(fā)揮作用，能夠抑制頭頸部腫瘤的轉(zhuǎn)移[22]。研究顯示，miR-204-3p在肺癌組織中呈低表達(dá)，與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[23-24]。本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TMPO-AS1和miR-204-3p存在相似結(jié)合位點(diǎn)，沉默TMPO-AS1后A549細(xì)胞中miR-204-3p的表達(dá)明顯升高，通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了TMPO-AS1和miR-204-3p存在靶向調(diào)控關(guān)系。本研究結(jié)果顯示沉默TMPO-AS1表達(dá)后可明顯促進(jìn)miR-204-3p的表達(dá)，沉默TMPO-AS1可抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示沉默TMPO-AS1表達(dá)可能靶向上調(diào)miR-204-3p的表達(dá)而抑制PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9表達(dá)及促進(jìn)Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)從而抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，TMPO-AS1在肺癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，沉默TMPO-AS1可通過(guò)誘導(dǎo)miR-204-3p的表達(dá)抑制肺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步了解非小細(xì)胞肺癌發(fā)病機(jī)制及探索潛在的治療靶點(diǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。