lncRNA SNHG8調控miR-335-5p表達影響膀胱癌增殖、遷移和侵襲的機制研究①

夏儒銳 梁培育 王聲興 歐善際 彭曉暉

(海南醫學院第一附屬醫院泌尿外科，海口 570102)

膀胱癌是世界范圍內最常見的癌癥之一，近年來其發病率呈上升趨勢。膀胱癌分為兩大類，非肌肉浸潤性和肌肉浸潤性[1]。大多數情況下的膀胱癌(75%～80%)是非肌肉侵襲性腫瘤，其復發率高達50%～70%[2]。盡管已有多種治療方法，如根治性膀胱切除術、保留膀胱的經尿道切除術、化學療法和放射療法，但轉移性膀胱癌的總生存期僅為13個月[3]。因此，迫切需要進一步探索膀胱癌腫瘤的發生和轉移分子機制，并找到新的治療策略來改善膀胱癌患者的預后。非編碼RNA是一種不編碼蛋白質，沒有完整開放閱讀框的轉錄副產物RNA，起初被認為是基因轉錄的“噪音”，現代研究證明，其在人類的多種癌癥中均具有調控作用[4]。長鏈非編碼RNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，微小RNA是長度介于18～24個核苷酸之間的短鏈內源性非編碼RNA，二者在人類癌癥的進展中均具有調控作用[5]。lnc RNA 小核仁RNA宿主基因8(small nucleolus RNA host gene 8，SNHG8)在人類的很多癌癥中均出現表達異常[6]，但是其在膀胱癌中是否會出現異常尚且未知。已知miR-335-5p在膀胱癌中作為抑癌基因發揮作用[7]，但是其與SNHG8之間的關系尚未完全清楚。本研究旨在探索lnc RNA SNHG8在膀胱癌細胞中增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 膀胱移行上皮細胞SV-HUC-1、膀胱癌細胞SW780、5637、T24、HT-1197均購自中國科學院細胞庫；噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑購自碧云天；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；BD Transwell小室購自北京明陽科華生物公司；RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa。實驗中所涉及的引物和質粒(si-con、si-SNHG8、miR-con、miR-335-5p mimics、SNHG8)由上海吉瑪公司設計并合成。pCDNA3.1(+)載體質粒購自上海酶研生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞的培養 將膀胱移行上皮細胞SV-HUC-1、膀胱癌細胞SW780、5637、T24、HT-1197用含有10 %胎牛血清的DMEM培養基進行常規細胞培養。

1.2.2細胞的轉染與分組 把正常培養的SV-HUC-1、SW780、5637、T24、HT-1197細胞分別標記為SV-HUC-1組、SW780組、5637組、T24組、HT-1197組。將SW780細胞隨機分為NC組(不做任何處理)、si-con組(轉染si-con)、si-SNHG8組(轉染si-SNHG8)、pcDNA組(轉染pcDNA)、pcDNA-SNHG8組(轉染pcDNA-SNHG8)、miR-con組(轉染miR-con)、miR-335-5p組(轉染miR-335-5p mimics)、si-SNHG8+anti-miR-con組(共轉染si-SNHG8和anti-miR-con)、si-SNHG8+anti-miR-335-5p組(共轉染si-SNHG8和anti-miR-335-5p)，各組細胞均用5倍量的脂質體進行轉染，轉染6 h后，更換新鮮培養基繼續培養48 h。用qRT-PCR法檢測轉染效率，轉染成功后用于后續的實驗研究。

1.2.3qRT-PCR法檢測細胞中SNHG8、miR-335-5p的表達 收集細胞，將其用RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑盒提取RNA并合成cDNA。再用qRT-PCR試劑盒檢測其中SNHG8、miR-335-5p的相對表達量。結果以GAPDH、U6為內參，2-ΔΔCt法計算SNHG8、miR-335-5p的表達。引物信息(5′-3′)：SNHG8上游引物AAGTTTACAAGCATGCGCGG，下游引物TCAAACTGACGGTTCTCGGG；GAPDH 上游引物CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC，下游引物ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC；miR-335-5p上游引物UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGC，下游引物CUCUCAUUUGCUAUAUUCA；U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTT-GCGT；反應條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環，最后延伸至72℃ 5 min。

1.2.4Western blot檢測細胞中Ki-67、Cleaved caspase-3、MMP-2、MMP-9的蛋白表達 收集培養48 h的待檢測細胞，充分裂解后，提取總蛋白，用BCA法定量。加入5倍體積的上樣緩沖液對蛋白進行沸水浴變性，用上清進行上樣。將蛋白小心加入梳子孔中，注意不要溢出孔外。電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，整個轉膜系統需要在4℃低溫條件下進行。然后5%脫脂奶粉封閉處理，一抗稀釋液4℃孵育過夜處理。第2天，將膜轉移至二抗稀釋液中室溫下孵育2 h。最后在暗室中進行顯影、定影和曝光。用Image J分析條帶的灰度值。

1.2.5MTT法檢測細胞存活率 收集培養48 h的待檢測細胞，調整細胞至5×105個/ml，取100 μl加入96孔板，依次加入20 μl的MTT液和150 μl的DMSO混勻溶解后，在490 nm波長下檢測細胞的吸光度。細胞存活率=A490樣品/A490對照×100%。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡 收集培養48 h的待檢測細胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒要求操作，依次加入Annexin V-FITC、PI，避光反應結束后，上流式細胞儀，檢測分析結果。

1.2.7Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲 采用帶基質膠的小室檢測細胞的侵襲數量，不含基質膠的小室檢測細胞的遷移數量。將培養48 h的待檢測細胞調整至5×105個/ml，用無血清培養基培養24 h，從中吸取200 μl平鋪在上室聚碳酸酯膜表面，以浸濕膜為準。取600 μl含血清的培養基加入下室內。將小室置于37℃培養箱內，培養24 h后取出小室。配置甲醇固定液和1 g/L的結晶紫染色液。先擦去上室膜的上表面殘余細胞，再將膜侵入甲醇中固定30 min，然后轉移至染液中染色15 min，結束后將膜進行封片，鏡檢。選取5個視野進行拍照計數，取平均值。每個樣本做3個復孔，實驗重復3次。

1.2.8生物信息學分析 通過在線預測網站mircode(http://mircode.org/)預測SNHG8的靶點。

1.2.9雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞熒光活性 通過熒光素酶與底物結合發生化學發光的特性，將化學合成的目的基因序列(SNHG8-WT)和突變序列(SNHG8-MUT)克隆在螢火蟲熒光素酶基因上游，構建熒光素酶報告質粒。再將其與miR-335-5p mimics、miR-NC共轉染至細胞。用裂解液充分裂解細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書要求操作，加入底物、終止液。結束后，檢測細胞的熒光強度，以海參熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值反映細胞的熒光活性。

2 結果

2.1SNHG8和miR-335-5p 在膀胱移行上皮細胞株和膀胱癌細胞中的表達 結果如表1所示，與SV-HUC-1組相比，SW780、5637、T24、HT-1197細胞中SNHG8表達均顯著升高，miR-335-5p表達均顯著降低(P<0.05)。

表1 SNHG8和miR-335-5p 在膀胱移行上皮細胞株和膀胱癌細胞的表達

2.2沉默SNHG8抑制膀胱癌細胞 SW780增殖和誘導細胞凋亡 結果如表2和圖1所示，與si-con組相比，si-SNHG8組細胞中SNHG8的mRNA表達顯著降低，Ki-67蛋白表達顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白表達顯著升高，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖1 沉默SNHG8對膀胱癌細胞 SW780增殖和細胞凋亡的影響

表2 SNHG8抑制膀胱癌細胞 SW780增殖和誘導細胞凋亡

2.3沉默SNHG8抑制膀胱癌細胞 SW780遷移和侵襲 結果如圖2和表3所示，與si-con組相比，si-SNHG8組細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)。

表3 沉默SNHG8抑制膀胱癌細胞 SW780遷移和侵襲

圖2 沉默SNHG8抑制膀胱癌細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達

2.4SNHG8靶向調控miR-335-5p 的表達 結果如圖3所示，SNHG8與miR-335-5p之間存在靶向結合位點。與miR-con組相比，miR-335-5p組WT-SNHG8細胞熒光活性顯著降低(表4)。與si-con組相比，si-SNHG8組細胞中SNHG8表達顯著升高，與pcDNA組相比，pcDNA-SNHG8組細胞中SNHG8表達顯著降低(表5)(P<0.05)。

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 SNHG8靶向調控miR-335-5p 表達

圖3 SNHG8與miR-335-5p 存在互補序列

2.5轉染miR-335-5p 抑制膀胱癌細胞 SW780增殖、遷移和侵襲及誘導細胞凋亡 結果如表6和圖4所示，與miR-con組相比，miR-335-5p組細胞中 miR-335-5p表達顯著升高，Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白表達顯著升高，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著降低，細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖4 轉染miR-335-5p對膀胱癌細胞凋亡以及增殖、凋亡、遷移相關蛋白表達的影響

表6 轉染miR-335-5p對膀胱癌細胞SW780增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

2.6干擾miR-335-5p 部分逆轉沉默SNHG8對膀胱癌細胞 SW780的抑制作用 結果如表7和圖5所示，與si-SNHG8+anti-miR-con組相比，si-SNHG8+anti-miR-335-5p組細胞中miR-335-5p表達顯著降低，Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達均顯著升高，Cleaved caspase-3蛋白表達顯著降低，遷移細胞數和侵襲細胞數均顯著升高，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

表7 轉染anti-miR-335-5p部分逆轉沉默SNHG8對膀胱癌細胞SW780增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

圖5 轉染anti-miR-335-5p部分逆轉沉默SNHG8對膀胱癌細胞SW780凋亡以及增殖、遷移、侵襲和凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

SNHG8在人類的很多癌癥中均作為致癌基因發揮促進癌癥發生發展的作用，但是其在膀胱癌中的研究甚少[8]。ZHEN等[9]在研究中發現，SNHG8在結直腸癌組織和細胞中顯著上調，另外，敲低SNHG8能夠明顯抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并且miR-663可與SNHG8相互作用，通過雙重熒光素酶報告基因分析證實了二者之間的靶向關系，此外，回補實驗表明SNHG8通過調節miR-663發揮了促進腫瘤惡化的作用，揭示了SNHG8在結直腸癌中被上調，并通過靶向miR-663促進結直腸癌的增殖、遷移和侵襲。DONG等[10]在研究中報道，在肝癌組織和細胞中，lncRNA SNHG8的表達水平明顯增加，并且是患者腫瘤復發的獨立預后因素，此外，SNHG8的敲低抑制細胞增殖、侵襲，而SNHG8的過表達則具有相反的作用，并且SNHG8可作為miR-149的靶標，明顯削弱miR-149在肝癌細胞中的抑癌作用，揭示lncRNA SNHG8可通過靶向抑制miR-149促進肝癌的發生和轉移。我們在本研究中檢測了膀胱癌細胞中SNHG8的表達，發現其異常升高，且沉默SNHG8能夠抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進凋亡，這與SNHG8在結直腸癌、肝癌中的作用相一致，說明了SNHG8也具有促進膀胱癌惡化的功能，這是首次發現該基因在膀胱癌中的功能；進一步通過生物信息學預測、雙熒光素酶報告基因檢測實驗發現SNHG8可靶向負調控miR-335-5p，這表明SNHG8在膀胱癌中的功能可能與調控miR-335-5p有關，也為膀胱癌的精準治療提供了新的作用靶標。這些實驗結果為SNHG8在其他癌癥中的功能開發提供了新的理論參考。

miRNA在癌癥的進展中具有重要的調控作用，其可作為上游的Lnc RNA、Circ RNA的靶標，也可與下游的靶基因結合進而干擾靶基因的表達，以發揮調控作用[11-12]。有研究報道，miR-335-5p能夠通過靶向絲裂原活化蛋白激酶1、Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶，抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲[13-14]。LIU等[15]發現，miR-335表達明顯降低，而CT10激酶樣蛋白的調節因子(CRKL)表達則明顯升高，CRKL被證實是miR-335在膀胱癌細胞中的特異性靶標，并且CRKL與miR-335表達之間的關系在膀胱癌組織中呈負相關，此外，膀胱癌細胞中的CRKL siRNA基團或miR-335模擬物能夠明顯抑制細胞增殖和遷移，揭示了miR-335可通過上調CRKL抑制膀胱癌細胞增殖和遷移。YANG等[7]在研究中發現，長鏈非編碼核糖核酸SLCO4A1-AS1(SLCO4A1-AS1)在膀胱癌中具有促進癌癥進一步惡化的作用，其機制之一為靶向miR-335-5p進而抑制八聚體結合轉錄因子4(OCT4)，可見miR-335-5p在膀胱癌惡化中的重要作用。本研究發現，miR-335-5p在膀胱癌細胞中的表達異常降低，并且過表達miR-335-5p可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進凋亡，而抑制miR-335-5p可部分逆轉沉默SNHG8對膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。這些實驗結果與前人的研究結果相一致，說明miR-335-5p為SNHG8的下游靶標之一，為癌癥的治療提供新方向。

綜上所述，長鏈非編碼RNA SNHG8可調控膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進凋亡，其機制與靶向miR-335-5p有關，為膀胱癌的治療提供參考依據。