基于PD-1/PD-L1表達影響探討四君子湯對NK細胞及結腸癌作用的研究①

朱月伊 宋運來 石曉蘭

(上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海 200062)

結腸癌是世界常見的惡性腫瘤之一，2018年就已經有接近180萬新患病例[1]。最近有研究表明，結腸癌的患病概率與吸煙相關[2]。盡管近年的存活率逐漸上升，但其難發現、易復發的特性使患者的治療前景不容樂觀[3]。

結腸癌由于發現不夠及時，其治療往往需要通過手術和放化療聯合應用，確診后，大部分患者會選擇手術治療，手術治療成為了結腸癌治療的主要手段[4]。然而，手術等療法存在復發及轉移的可能，導致結腸癌的治療更加棘手。

近年來，免疫療法發展迅速，NK細胞得到了前所未有的重視。其不通過繁瑣的信號通路調控就可直接快速地清除感染或被腫瘤侵占的細胞。而NK細胞自身擁有的多個膜表達活化受體及不同表型子集，也是發揮它強大免疫反應的關鍵[5-6]。正因為這種特殊性，一旦NK細胞表面受體被信號介導抑制，就會失去對病毒防御和對腫瘤監視的能力[7]。程序性死亡受體1(PD-1)是一種免疫學檢查位點，常見于T淋巴細胞，該位點可與其對應的配體結合，激活相關信號通路，抑制T淋巴細胞的免疫反應，從而發生免疫逃逸。但與T淋巴細胞相關的NK細胞在PD-1方向還在深入探索中。大量研究數據顯示，NK細胞對PD-1/PD-L1通路產生影響[8]。NK細胞表面存在PD-1，PD-1受體不僅抑制T細胞，還抑制NK細胞，且腫瘤活性的提升與PD-1表達上調密切相關，尤其在結腸癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌中[9-11]。因此，抑制PD-1表達可能為NK細胞加強免疫反應提供幫助。STAT3是一種由770個氨基酸組成的蛋白質，其通過STAT結構區域與特定的磷酸酪氨酸序列結合在信號傳導中起關鍵作用[12]。而作為轉錄因子，STAT3可直接結合啟動子增加PD-1、PD-L1表達，也可以通過多種信號通路間接誘導這些因子的免疫檢查點分子的表達[13-17]。盡管IFN-γ在臨床多用于治療惡性腫瘤，但最新研究顯示其還可能促進腫瘤發展，并借由JAK/STAT3通路產生影響[18]。

四君子湯出自《太平惠民和劑局方》，是中醫補益正氣的經典代表方，由人參、白術、茯苓、炙甘草4藥相伍而成，方中人參大補元氣為君藥，白術燥濕補氣為臣藥，茯苓滲濕泄熱為佐藥，甘草和中益土為使藥，四藥相合共行補脾益氣之功效，臨床上常用于治療慢性胃炎、消化性潰瘍、結腸癌等脾胃氣虛病癥。

1 材料與方法

1.1材料 人結腸癌細胞株HCT116購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；RPMI-Medium培養基購自美國HyClone公司；胰酶與血清購自美國Gibco公司；MTT、SDS購自中國Sangon公司；人外周血淋巴分離液TBD購自中國灝洋生物公司；人NK細胞富集試劑盒購自加拿大Stemcell Technology公司；RNA試劑盒及逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；IFN-γ ELISA試劑盒購自中國LIANKE公司；PCR引物購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司；Napabucasin STAT3抑制劑購自美國MCE公司；血液標本購置自上海市長海醫院血站，標本來自健康人，所有的指標都在范圍內；四君子湯中藥制備于上海中醫藥大學中藥學院，藥材購自上海市雷允上藥業有限公司。常用離心機購自德國Eppendorf公司；梯度離心機、超低溫冰箱及酶標儀等購自美國Thermo公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Life Technologies公司；顯微鏡購自德國Leica公司；小型垂直電泳槽及小型Trans-Blot轉印槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1NK細胞的分離 將得到的標本以1∶1比例稀釋于含有3%雙抗的PBS(1X)溶液，待充分稀釋后，與人外周血淋巴分離液以2∶1比例置于15 ml 小離心管，共12 ml，先放入4 ml分離液后緩慢加入8 ml稀釋標本，配平至離心機，25℃、400 XG、20 min離心。離心后分為4層，用吸管緩慢少量多次吸取第2層液面(即淋巴細胞層)，盡量吸盡，并再次加入含3%雙抗的PBS(1X)溶液，25℃、200 XG下離心10 min，棄上清，加入含20%血清、1%雙抗的1640培養液，電子計數至3×106個/ml,并將其以10 ml/皿均勻鋪開，24 h后吸取上清液重復上述第二步離心，所得沉淀即為低濃度NK細胞。利用NK細胞富集試劑盒進行磁珠分選，排除非目的細胞，最后流式細胞術檢測CD56+以評估NK細胞純度，純度 >90%即為實驗所需。

1.2.2細胞的處理與分組 單一NK細胞鋪板每孔3×106個/ml。在共培養模型中，NK細胞與HCT116比例為5∶1鋪板，并盡量保持孔內體積較小，HCT116細胞以1×104個/10 μl加至5×104個/100 μl 的NK細胞中。設200 ng/ml IFN-γ處理的NK細胞為IFN-γ組，200 ng/ml IL-2處理的NK細胞為IL-2組(陽性對照組)，5 mg/ml四君子湯處理的NK細胞為SJZ組，100 μmol/L奧沙利鉑處理的NK細胞為OXA組(陽性對照組)，正常處理的NK細胞為Con組，分別單獨培養NK細胞，與HCT116細胞共培養24 h及48 h。同時以相同方式再加入STAT3信號抑制劑后，即為R-STAT3組、R-SJZ組、R-OXA組，共培養24 h及48 h 后進行后續實驗。

1.2.3建立小鼠結腸癌皮下瘤模型 用生理鹽水將CT-26細胞調整為5×106個/ml,以0.2 ml/只皮下注射至小鼠右側腋下，接種2 d后檢查小鼠皮下瘤生長情況，待瘤體達到100 mm3后，通過完全隨機法將小鼠分為4組，每組6只，分別為空白組(CON)、生理鹽水組(NACL)、四君子湯組(SJZ)和奧沙利鉑組(OXA)，空白組不作任何處理，NACL組、SJZ組以0.2 ml/(只·d)灌胃給藥，OXA組每隔1 d進行1次腹腔注射給藥，0.1 ml/(20 g·只)，并持續2周。

1.2.4MTT法檢測細胞毒性 細胞處理到24 h及48 h后，單一NK細胞每孔加入10 μl 5 mg/ml的MTT,3.5 h后，每孔加入100 μl 10%SDS溶液,24 h后，上樣酶標儀檢測，讀取波長570 nm處OD值并進行統計計算。共培養模型中的HCT116細胞需要先用移液器輕吹，少量多次緩慢吸取上清液，加入新的含20%血清、1%雙抗的培養液100 μl后，再進行上述常規的加入MTT操作。

1.2.5qRT-PCR檢驗mRNA表達 細胞共培養24 h 及48 h后，輕吹各孔得到上清液，由于HCT116腫瘤細胞與NK細胞體積密度不同，以差速離心法得到NK細胞沉淀。以相同方法得到腫瘤細胞沉淀，加入適量TRIzol溶液溶解，通過異丙醇，氯仿，無水乙醇獲得RNA，并逆轉錄成cDNA，qRT-PCR檢測mRNA表達，PCR反應條件為：95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 34 s，40個循環，最后得到數值后利用2-ΔΔCt法進行數值統計。小鼠皮下瘤的RNA提取需要先將腫塊剪碎后放入磁珠，再加入適量TRIzol溶液并放到動物RNA提取儀器中60 Hz、2次/min振蕩，再進行后續操作。

1.2.6ELISA檢測IFN-γ水平 細胞共培養24 h及48 h后，獲得各組上清液，根據IFN-γ試劑盒說明書建立標準曲線方程，最后得到的OD值代入方程中進行換算得到IFN-γ分泌量。小鼠眼球血液的上清液需以3 000 r/min 4℃離心5 min。

1.2.7活體成像技術 小鼠給藥2周后，以每只小鼠200 μl/20 g、15 mg/ml的熒光素鉀鹽進行腹腔注射，根據體重利用戊巴比妥鈉麻醉[50 μl/(20 g·只)]，待小鼠失去行動能力后，置于活體成像儀進行檢測。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達 摘取小鼠皮下瘤后，各組剪取相同統計大小的腫塊進行RIPA裂解，并放入組織勻漿器中充分研磨，以12 000 r/min 4℃離心5 min，得到上清液。根據蛋白濃度試劑盒標準方程，按照步驟操作后在酶標儀波長 570 nm 處取得OD值，換算得到蛋白濃度。根據PD-L1蛋白大小配膠，10%的分離膠，5%的濃縮膠，蛋白在定量后根據體積加入5 X上樣緩沖液，95℃金屬浴10 min，隨后以3 000 r/min、4℃離心1 min。上樣完畢后，恒壓70 V電泳30 min,然后根據標準線指示轉為恒壓90 V，視情況而定等待1～2 h，隨后轉膜并封閉，洗膜后加入PD-L1的稀釋一抗4℃孵育過夜。回收一抗洗膜3次后，加入二抗，室溫孵育2 h，再次洗膜3次，最后加化學發光試劑顯影，得到數據后通過Image J軟件換算灰度值并進行統計分析。

1.2.9免疫組化實驗 將取得的皮下瘤進行石蠟切片，用二甲苯與無水乙醇常規脫蠟，滅活后進行封閉并加入抗體孵育，二抗孵育完成后PBS(1 X)沖洗4次，根據顯色試劑盒說明書，加入顯色試劑，最后用無水乙醇沖洗、封片并在顯微鏡下觀察。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度值測定并進行統計分析。

2 結果

2.1IFN-γ可抑制NK細胞生長 IFN-γ在200 ng/ml 下可以抑制NK細胞生長(P<0.05)，四君子湯在NK細胞存在的情況下，可以增強對HCT116細胞的殺傷作用(P<0.01)，奧沙利鉑在抑制NK細胞生長的同時，也抑制了HCT116細胞增殖(P<0.05)。見表1。

表1 IFN-γ和四君子湯對NK細胞活性及共培養模型中HCT116的增殖影響

2.2四君子湯可降低NK細胞分泌IFN-γ的水平 四君子湯可降低單一NK細胞IFN-γ的分泌(P<0.05)，且在與STAT3抑制劑聯合使用后抑制作用更加明顯(P<0.05)。在共培養模型中，四君子湯聯合STAT3抑制劑依舊可降低IFN-γ分泌(P<0.05)。見表2。

表2 四君子湯和STAT3抑制劑對NK細胞及共培養模型中IFN-γ分泌的影響

2.3四君子湯可降低NK細胞 mRNA表達 四君子湯可降低共培養模型中NK細胞IFN-γ(P<0.05)、PD-1(P<0.05)、STAT3(P<0.01)的表達(P<0.01)，且在與STAT3抑制劑聯合后，更為顯著降低IFN-γ(P<0.05)、PD-1(P<0.05)、STAT3 24 h(P<0.05)。相同的是，四君子湯與STAT3抑制劑聯合使用也可降低共培養模型中HCT116細胞PD-L1、STAT3 mRNA的表達(P<0.05)。見表3、4。

表3 四君子湯和STAT3抑制劑對共培養模型中NK細胞mRNA的影響

表4 四君子湯和STAT3抑制劑對共培養模型中HCT116細胞 mRNA的影響

2.4四君子湯可抑制小鼠結腸癌皮下瘤生長，并降低PD-L1蛋白及抗體表達 四君子湯可降低PD-L1蛋白及抗體表達(P<0.05，圖1)，還可抑制小鼠結腸癌皮下瘤的生長，其熒光強度低于NACL組和空白組(P<0.05，圖2)。

圖1 PD-L1蛋白表達

圖2 小鼠熒光強度

2.5四君子湯可降低小鼠結腸癌皮下瘤PD-L1 mRNA表達和血液中IFN-γ分泌 四君子湯可降低小鼠結腸癌皮下瘤PD-L1 mRNA表達(P<0.01)，并可降低其血液中IFN-γ分泌(P<0.05)。見圖3。

圖3 PD-L1 mRNA及IFN-γ水平

3 討論

NK細胞在腫瘤的殺傷中起關鍵作用，當NK細胞表面的PD-1與腫瘤的免疫檢查位點PD-L1結合時，NK細胞表達的活化受體將無法激活，細胞活化、分裂、細胞毒性等能力減弱，導致腫瘤免疫逃脫，使免疫反應無法進行。因此，降低PD-1或PD-L1表達，抑制二者結合及信號通路形成可有效避免NK細胞衰弱，達到增強免疫反應的目的[10，19]。

既往研究發現，STAT3的異常激活可通過傳播腫瘤細胞與腫瘤微環境之間串擾導致腫瘤免疫反應的抑制，在自身激活活化的同時，促進其他免疫抑制因子表達[20]。最近發現，CD4+T細胞PD-1表達可上調STAT3 mRNA[21]，免疫檢查位點抑制劑和STAT3抑制劑聯合使用在臨床上也達到了預期效果[22]。同時，也有研究發現，STAT3在腫瘤浸潤免疫細胞中過度活化會影響先天免疫和適應性免疫應答，從而引起免疫抑制。例如在先天免疫細胞中存在大量的STAT3，可能會引發以降低IFN-γ為代表的炎性介質的一系列反應，從而減緩炎癥信息的傳遞，導致免疫抑制，在適應性免疫中，STAT3活性的持續升高會導致T淋巴細胞活性降低，導致抗腫瘤作用降低[23-25]。四君子湯作為中藥的經典方可以殺傷腫瘤細胞[26]，最近發現其中蘊含的多糖可以對淋巴細胞、脾細胞以及巨噬細胞發揮不同的免疫作用[27]，而加味四君子湯也具有很好的抗腫瘤活性，還可以改善荷瘤小鼠的肝腎功能，其作用可能歸功于IL-2、TNF-α等[28]。最近有研究表明，LY294002 PI3K/AKT信號通路抑制劑可抑制IFN-γ分泌和經番茄素處理的肺癌細胞PD-L1的表達[29]。

綜上所述，四君子湯可影響NK細胞活性及結腸癌增殖，其功能與STAT3抑制劑相近，可能通過調控STAT3信號干預IFN-γ分泌，降低PD-1/PD-L1的表達從而改善NK細胞活性并抑制結腸癌的細胞的生長，可為結腸癌的臨床治療及實驗研究提供依據。