安石榴苷通過miR-132-5p/TRAF6途徑調控oxLDL誘導的血管平滑肌細胞損傷的分子機制

陳 剛 陳九霖 吳 俊

(黔西南州人民醫院心血管內科，興義 562400)

動脈粥樣硬化是臨床常見的一種炎癥性疾病，其主要病理特征為脂質沉積形成動脈管壁脂肪條紋導致粥樣斑塊的形成，并可引發缺血性心臟病等心血管疾病，目前心血管疾病發病率與死亡率較高，發病率逐年上升[1-2]。研究表明動脈粥樣硬化是增加心血管疾病發病率與死亡率的危險因素[3]。因而尋找治療動脈粥樣硬化的藥物對心血管疾病的預防及治療均具有重要意義。安石榴苷(punicalagin，PUN)是石榴皮多酚的主要活性成分，研究表明PUN具有抗炎、抗氧化等多種生理活性，還可通過抗氧化作用而減輕慢性支氣管炎大鼠的炎癥反應[4-5]。但PUN對動脈粥樣硬化的治療效果及其可能作用機制尚未可知。微小RNA-132-5p(microRNA-132-5p，miR-132-5p)在急性心肌梗死患者中呈低表達，藥物處理后可能通過提高miR-132-5p的表達達到治療效果[6]。StarBase預測顯示腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)可能是miR-132-5p的靶基因，研究表明沉默TRAF6表達可抑制炎癥相關細胞因子及炎癥介質表達水平從而減輕內毒素/半乳糖誘導的小鼠急性肝損傷[7]。但PUN是否通過miR-132-5p/TRAF6途徑調控氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)誘導的血管平滑肌細胞損傷尚未可知。本研究主要探討PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞凋亡及炎癥反應的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 PUN購自濟寧天之藍生物科技有限公司；人主動脈血管平滑肌細胞HA-VSMC購自美國ATCC細胞庫；oxLDL購自上海魯汶生物科技有限公司；杜氏改良培養基(DMEM)、胎牛血清均購自賽默飛世爾科技公司；miR-132-5p模擬物(mimics)及陰性對照(miR-NC)、miR-132-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-132-5p)及其陰性對照(anti-miR-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；TRIzol試劑、反轉錄與熒光定量PCR試劑盒均購自大連TaKaRa公司；膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；兔抗人TRAF6抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗人B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體購自上海玉博生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1藥物處理及實驗分組 人主動脈血管平滑肌細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，用50 mg/ml的oxLDL處理血管平滑肌細胞24 h構建動脈粥樣硬化模型[8]。Con組采用等量生理鹽水處理細胞。收集造模后的血管平滑肌細胞，用不同濃度的PUN處理 24 h，分別記作oxLDL+PUN-L組(5 μg/ml PUN)、oxLDL+PUN-M組(10 μg/ml PUN)、oxLDL+PUN-H組(20 μg/ml PUN)[9]。后續實驗觀察miR-132-5p過表達及抑制miR-132-5p表達對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞損傷的影響，實驗分組：oxLDL+miR-NC組(miR-NC轉染至血管平滑肌細胞48 h，隨后使用oxLDL處理24 h)、oxLDL+miR-132-5p組(miR-132-5p mimics轉染至血管平滑肌細胞48 h，隨后使用oxLDL處理24 h)、oxLDL+PUN+anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉染至血管平滑肌細胞48 h，隨后用50 mg/ml oxLDL與20 μg/ml PUN共同處理24 h)、oxLDL+PUN+anti-miR-132-5p組(anti-miR-132-5p轉染至血管平滑肌細胞48 h，隨后用50 mg/ml oxLDL與20 μg/ml PUN共同處理 24 h)。

1.2.2ELISA檢測IL-1β、TNF-α濃度 收集各組細胞培養上清，采用IL-1β、TNF-α ELISA檢測試劑盒檢測IL-1β、TNF-α濃度，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 取各組血管平滑肌細胞，預冷PBS洗滌，加入1×Binding buffer制備細胞懸液(1×106個/ml)，加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，室溫避光孵育15 min，加入400 μl結合緩沖液置于流式細胞儀檢測并計算細胞凋亡率。

1.2.4實時定量PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR，qRT-PCR)檢測細胞中miR-132-5p、TRAF6 mRNA表達水平 取oxLDL+miR-NC組、oxLDL+miR-132-5p組、oxLDL+PUN+anti-miR-NC組、oxLDL+PUN+anti-miR-132-5p組血管平滑肌細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，利用紫外分光光度計檢測RNA濃度。按照反轉錄試劑盒說明書配置反應體系得到cDNA。miR-132-5p正向引物：5′-TGGATCCCCCCCAGTCCCCGTCCCTCAG-3′，反向引物：5′-TGAATTCGGATACCTTGGCCGGGA-GGAC-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGC-ACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TRAF6正向引物：5′-AGTTGTGTGCGTGTGACA-GT-3′，反向引物：5′-ATGTAGCTGCGTCGCTTGTA-3′；GAPDH正向引物：5′-AACGGATTTGGTCGTAT-TG-3′，反向引物：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。根據試劑盒說明書配置qRT-PCR反應體系，置于實時熒光定量PCR儀檢測各基因Ct值，反應條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環40次。miR-132-5p以U6為內參基因，TRAF6以GAPDH為內參基因，反應結束后，采用 2-ΔΔCt法計算miR-132-5p、TRAF6 mRNA相對表達量。

1.2.5熒光素酶報告基因檢測 靶基因預測網站StarBase預測顯示TRAF6的3′UTR中含有與miR-132-5p互補的核苷酸序列，將含有結合位點的TRAF6-3′UTR插入構建野生型載體WT-TRAF6，利用基因突變技術將結合位點進行突變，將含有突變位點的TRAF6-3′UTR插入構建突變型載體MUT-TRAF6，取對數期血管平滑肌細胞，將WT-TRAF6、MUT-TRAF6分別與miR-NC、miR-132-5p mimics共轉染至血管平滑肌細胞，檢測各組熒光素酶活性。為驗證miR-132-5p對TRAF6表達的調控作用，通過Western blot檢測miR-132-5p過表達或抑制miR-132-5p的表達后細胞中TRAF6蛋白表達情況，實驗分組：miR-NC組、miR-132-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-132-5p組，轉染時嚴格按照Lipofectamine2000試劑盒說明書進行操作。

1.2.6Western blot檢測TRAF6、Bax、Bcl-2蛋白表達 收集各組對數期血管平滑肌細胞，加入蛋白裂解液提取蛋白，采用BCA法定量蛋白，加入5×上樣緩沖液，沸水中煮10 min，蛋白變性，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜、封閉，加入TRAF6(1∶1 000)、Bax(1∶800)、Bcl-2(1∶800)一抗，TBST洗膜，加入二抗(1∶5 000)，TBST洗膜，滴加ECL反應，暗室內曝光顯影，應用Quantity One軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參照條帶灰度值。

2 結果

2.1PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞炎癥因子表達的影響 實驗結果顯示，與Con組相比，oxLDL組血管平滑肌細胞中促炎因子IL-1β、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；與oxLDL組相比，oxLDL+PUN-L組、oxLDL+PUN-M組、oxLDL+PUN-H組血管平滑肌細胞中促炎因子IL-1β、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)；oxLDL+PUN-H組血管平滑肌細胞中促炎因子IL-1β、TNF-α水平均顯著低于oxLDL+PUN-L組、oxLDL+PUN-M組(P<0.05)，PUN不同劑量組間IL-1β、TNF-α水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞炎癥因子表達的影響

2.2PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞凋亡的影響 與Con組相比，oxLDL組血管平滑肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)；與oxLDL組相比，oxLDL+PUN-L組、oxLDL+PUN-M組、oxLDL+PUN-H組血管平滑肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，PUN不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，其中oxLDL+PUN-H組作用效果最為顯著(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞凋亡的影響

表2 PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞凋亡的影響

2.3PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞中miR-132-5p和TRAF6表達的影響 與Con組相比，oxLDL組血管平滑肌細胞中miR-132-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)，TRAF6 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與oxLDL組相比，oxLDL+PUN-L組、oxLDL+PUN-M組、oxLDL+PUN-H組血管平滑肌細胞中miR-132-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)，TRAF6 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，PUN不同劑量組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，其中oxLDL+PUN-H組作用效果最為顯著(P<0.05)，見圖2、表3。

表3 PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞中miR-132-5p和TRAF6表達的影響

圖2 TRAF6蛋白表達

2.4miR-132-5p靶向調控TRAF6的表達 StarBase預測顯示TRAF6的3′UTR中含有與miR-132-5p互補的核苷酸序列，見圖3A。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，轉染野生型載體WT-TRAF6的細胞中，與miR-NC組相比，miR-132-5p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；轉染突變型載體MUT-TRAF6的細胞中，miR-132-5p組與miR-NC組熒光素酶活性相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。Western blot檢測結果顯示，與miR-NC組比較，miR-132-5p組TRAF6蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-132-5p組TRAF6蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，見圖3B、表5。

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 miR-132-5p調控TRAF6蛋白表達

圖3 miR-132-5p靶向調控TRAF6的表達

2.5miR-132-5p過表達對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞損傷的影響 與oxLDL+miR-NC組比較，oxLDL+miR-132-5p組血管平滑肌細胞中miR-132-5p的表達水平顯著升高(P<0.05)，TRAF6蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，促炎因子IL-1β、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，見圖4、表6。

表6 miR-132-5p過表達對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞損傷的影響

圖4 miR-132-5p過表達對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞凋亡的影響

2.6抑制miR-132-5p表達逆轉PUN(20 μg/ml)對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞損傷的作用 與oxLDL+PUN+anti-miR-NC組相比，oxLDL+PUN+anti-miR-132-5p組血管平滑肌細胞中miR-132-5p的表達水平顯著降低(P<0.05)，TRAF6蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，促炎因子IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，見圖5、表7。

表7 抑制miR-132-5p表達逆轉了PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞損傷的作用

圖5 抑制miR-132-5p表達逆轉PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞凋亡的作用

3 討論

動脈粥樣硬化的發病機制尚未闡明，研究表明血管平滑肌細胞過度凋亡、炎癥反應可能是引發動脈粥樣硬化的重要原因[10]。目前臨床主要采用降膽固醇或降血壓、抗炎等藥物治療動脈粥樣硬化，既往研究顯示部分藥物可通過抑制血管炎癥及血管平滑肌細胞凋亡從而抑制動脈粥樣硬化的發生及發展，但副作用較大[11]。因而尋找安全且副作用較小的中草藥提取物具有重要意義。

PUN具有抗氧化、抗癌、抗炎等功能，可有效緩解腫瘤、炎癥相關性疾病等多種疾病發生及發展[12]。研究表明PUN可通過抗氧化作用減輕腦缺血再灌注損傷[13]。相關報道指出PUN可通過降低心肌氧化應激、減少心肌細胞凋亡從而減輕心肌缺血再灌注損傷[14]。但PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞損傷的影響尚未可知。本研究結果顯示oxLDL處理后促炎因子IL-1β、TNF-α水平顯著升高，與相關文獻結論相似[15]。提示成功建立oxLDL誘導的血管平滑肌細胞動脈粥樣硬化模型。不同濃度的PUN處理后細胞中促炎因子IL-1β、TNF-α水平顯著降低，且呈劑量依賴性。提示PUN可減輕oxLDL誘導的血管平滑肌細胞炎癥反應。血管平滑肌細胞異常凋亡可促進動脈粥樣硬化斑塊的形成從而促進動脈粥樣硬化發展，研究表明Bcl-2是抑制細胞凋亡基因，Bax是促凋亡基因，Bcl-2表達水平升高、Bax表達水平降低則細胞凋亡被抑制[16-17]。本研究結果顯示，oxLDL處理后細胞凋亡率顯著升高，而PUN處理后細胞凋亡率顯著降低，隨著PUN使用劑量的增加而顯著降低，進一步研究顯示oxLDL可降低細胞中Bcl-2的表達，促進Bax的表達，而PUN處理后細胞中Bcl-2的表達水平顯著升高，Bax的表達水平顯著降低，且隨著PUN使用劑量的增加而明顯變化，提示PUN可減弱動脈粥樣硬化模型中人主動脈血管平滑肌細胞凋亡。

miR-132-5p在急性心肌梗死患者血漿中表達下調，并可作為急性心肌梗死早期診斷的生物標志物[18]。研究表明TRAF6激活后可誘導單核/巨噬細胞產生TNF-α等炎癥因子而引發動脈壁炎癥反應從而促進動脈粥樣硬化發生及發展[19]。相關報道指出抑制TRAF6的表達可能通過抑制TLR4信號通路而抑制炎癥因子的釋放從而抑制動脈粥樣硬化的發生[20]。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blot實驗證實miR-132-5p可靶向結合TRAF6，并可負向調控TRAF6的表達，進一步研究顯示miR-132-5p過表達可通過下調TRAF6的表達，降低炎癥因子IL-1β、TNF-α水平，抑制oxLDL誘導的血管平滑肌細胞凋亡，還可促進Bcl-2的表達，而抑制Bax的表達，提示miR-132-5p過表達可通過靶向TRAF6減弱oxLDL誘導的血管平滑肌細胞凋亡，抑制炎癥反應。同時本研究進一步分析顯示抑制miR-132-5p的表達后可明顯逆轉PUN對oxLDL誘導的血管平滑肌細胞凋亡及炎癥反應的抑制作用。提示PUN可能通過上調miR-132-5p的表達及下調TRAF6的表達從而改善凋亡標記蛋白表達的異常，抑制促炎因子水平的升高從而減緩動脈粥樣硬化發展進程。

綜上所述，PUN可通過調控miR-132-5p/TRAF6分子軸而發揮抗炎及抑制血管平滑肌細胞凋亡的作用，可為動脈粥樣硬化新藥的研發提供理論依據。但仍需進行體內實驗探索PUN對動脈粥樣硬化的影響。