順式阿曲庫銨對人乳腺癌MCF-7細胞株生物學特性影響的實驗研究①

張 君 歐冊華 劉 莉 賈 飛 洋 超 趙 鵬

(西南醫科大學附屬醫院疼痛科，瀘州 646000)

乳腺癌已成為全球發病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，嚴重危害女性生命健康[1]。雖然我國乳腺癌發病率相對發達國家較低，但近年來我國乳腺癌患者逐年遞增，且發病率趨于年輕化[2-3]。手術切除和化療輔助治療為目前主要的治療方式，但手術切除和化療輔助治療均會給患者帶來嚴重的生理和心理創傷，因此尋求藥物輔助抑制乳腺癌腫瘤細胞的運動及活性尤為重要[4]。順式阿曲庫銨是阿曲庫銨的一種同分異構體，是一種手術麻醉藥物[5]。YABASIN等[6]研究表明，順式阿曲庫銨可通過線粒體誘導癌細胞凋亡。本文旨在研究順式阿曲庫銨對人乳腺癌MCF-7細胞株生物學特性影響，以期了解順式阿曲庫銨對人乳腺癌MCF-7細胞株的作用機制，從而為乳腺癌的輔助治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞來源 乳腺癌MCF-7細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 順式阿曲庫銨購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(國藥準字：H20060869)；E-cadherin、Vimentin抗體購自上海滬尚生物科技有限公司；DMEM培養基、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶購自上海生工生物股份有限公司；EDU(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine)購自美國Sigma公司；N-cadherin抗體購自Santa Cruze Biotechnology 公司；Bax、Bcl-2抗體購自武漢華聯科有限公司；細胞色素C(cytochrome C)、PARP和cleaved PARP抗體購自南京建成生物工程研究所；VEGF抗體購自武漢博歐特生物科技有限公司；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Hoechst染色劑購自武漢默沙克生物科技有限公司；VEGF熒光試劑盒購自江萊生物有限公司；TRIzol 試劑購自Thermo Fisher公司。

1.1.3儀器 CO2培養箱購自日本SanYo公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統有限公司；TDL-5 型臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠；光學顯微鏡購自東莞市同創儀器有限公司；低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統購自以色列DNR公司；Line gegn 9600 PCR儀購自石家莊奧龍科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組 將各組乳腺癌MCF-7細胞培養于37℃、5%CO2、含10%新生小牛血清的DMEM培養液中。每2 d更換1次培養液，細胞長滿瓶底后消化傳代，取對數生長期的細胞進行培養。將細胞用PBS緩沖液清洗3次，加入0.25%的胰蛋白酶溶液消化，當細胞變圓即將脫離瓶壁時，停止消化。計數后將細胞轉移至新的培養瓶中繼續培養。

1.2.2藥物干預 調整對數生長期細胞濃度為1×105個/ml，以100 μl/孔接種于96孔板，37℃、5% CO2條件下過夜培養(約16 h)，各組分別使用含0、5、10、20 μmol/L順式阿曲庫銨的完全培養基 200 μl 培養24 h。并根據處理濃度分為對照組、順式阿曲庫銨5 μmol/L組、順式阿曲庫銨10 μmol/L組、順式阿曲庫銨20 μmol/L組。

1.2.3細胞增殖檢測 取上述藥物干預后的各組細胞，根據EDU染色試劑盒說明書，用完全培養基將EDU稀釋至10 μmol/L，每孔加入100 μl，孵育4 h 后棄培養基，PBS清洗2次，多聚甲醛固定，Apollo染色，立即檢測或用抗熒光淬滅封片后檢測細胞增殖情況。采用克隆形成實驗檢測細胞生長，取對數生長期細胞，制作1×105個/ml單細胞懸液并計數，并將細胞接種至6孔板中梯度培養，2周后顯微鏡下可見明顯克隆形成，結晶紫染色后拍照，并計算克隆形成率。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 取上述藥物干預后的各組細胞，使用胰酶消化，在4℃離心機中離心 5 min 收集細胞；收集細胞后加入100 μl Binding Buffer重懸，并加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI輕輕混勻；室溫避光孵育 15 min并加入400 μl Binding Buffer使用流式細胞儀檢測。

1.2.5Hoechst染色法觀察細胞凋亡 取上述藥物干預后的各組細胞，待乳腺癌MCF-7細胞長至80%匯合度，胰蛋白酶消化，以1.5×106個/孔接種于6孔板，預先置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h。加入DMEM基礎培養基稀釋的SiO2溶液，再次培養24 h，PBS洗滌2次后每孔加入1 ml Hoechst 33342染色液于37℃培養箱中孵育25 min，而后室溫下避光孵育15 min，在熒光顯微鏡下以紫外光激發，觀察并計數。每組隨機選取視野，計算凋亡細胞數和細胞總數(每組不少于1 000個)，并計算凋亡率。

1.2.6劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將劃痕實驗插件置于24孔板，取上述藥物干預后的各組細胞，調整對數生長期的乳腺癌MCF-7細胞調至5×105個/孔，37℃、5% CO2條件下過夜培養，次日小心移去劃痕實驗插件，用完全培養基潤洗3次，加入10 μmol/L 絲裂霉素，繼續培養2 h，更換新鮮完全培養基，100倍顯微鏡下拍照記為0 h，繼續培養24 h 后拍照，分析細胞的遷移情況，實驗重復3次。

1.2.7Transwell法檢測細胞侵襲能力 取上述藥物干預后的各組細胞，Transwell小室中將5 μg 纖黏連蛋白用移液器均勻涂抹在小室內的PVDF聚碳酸濾膜外表面；膜內側表面涂5 μg matrigel。調整細胞量2×105個/孔，設置3個復孔；加入不同濃度的阿曲庫銨于37℃、5% CO2溫箱培養4 h。PBS清洗3次并去除小室中膜內側表面多余的細胞，以多聚甲醛固定；400倍顯微視野下隨機選取10個視野，倒置顯微鏡下采用雙盲計數法統計膜下表面的細胞數目平均值。實驗重復3次。

1.2.8Western blot 檢測蛋白表達水平 取上述藥物干預后的各組細胞，吸除培養皿中的培養基保存于滅菌離心管。1 200 r/min離心10 min后加入裂解液重懸細胞，冰中裂解30 min，再次以1 200 r/min離心10 min，加入200 μl Loading Buffer 緩沖液，100℃煮沸 10 min；以BCA法測定蛋白濃度后，SDS-PAGE電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉移至PVDF膜后放入 TBST 溶液中緩慢搖動洗膜5 min，再將 PVDF 膜放入配制好的一抗(1∶500)中孵育，室溫下搖動30 min后放入4℃恒溫箱中過夜。取出后使用TBST洗滌3次后放入二抗反應液中室溫孵育 2 h；封閉液：二抗為2 000∶1；曝光后以Actin為內參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值為相對蛋白表達水平。

1.2.9免疫熒光法檢測VEGF陽性表達情況 取對數生長期乳腺癌MCF-7細胞，調整細胞濃度為2.5×105個/ml，取2 ml接種于6孔板，37℃、5% CO2條件下過夜培養(約16 h)。按照VEGF熒光試劑盒說明書加入固定液固定10 min，棄固定液，PBS清洗3次，加入免疫染色液，室溫封閉1 h，加入DAPI染液，室溫染色5 min，洗滌液洗滌2次，加入抗淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.10RT-PCR檢測VEGF基因表達 TRIzol 試劑提取各組細胞總 RNA，測定 RNA 濃度和純度，反轉錄試劑盒合成 cDNA后PCR擴增，按照試劑盒操作說明書檢測RNA表達水平，以Actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算RNA的相對表達量。

1.3統計學分析 本研究數據分析采用SPSS22.0軟件，作圖軟件采用GraphPda Prism5，方差分析使用單因素方差分析，使用單因素方差分析時，以P<0.05為數據差異有統計學意義。

2 結果

2.1細胞增殖能力檢測結果 相比于對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組EDU陽性細胞數目無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10 μmol/L、20 μmol/L組EDU陽性細胞數目顯著降低(P<0.05，圖1A)。由圖1B可知，相比于對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L 組細胞克隆形成率無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L 組細胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)。

圖1 細胞增殖能力檢測結果

2.2細胞凋亡檢測結果 由圖2A可知，相比于對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。由圖2B可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖2 細胞凋亡檢測結果

2.3細胞運動能力檢測結果 相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組侵襲細胞數目無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組侵襲細胞數目顯著降低(P<0.05，圖3A)。相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細胞遷移率無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組細胞遷移率顯著降低(P<0.05，圖3B)。

圖3 細胞運動能力檢測結果

2.4細胞運動相關蛋白檢測結果 由圖4A可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組N-cadherin蛋白表達顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)；由圖4B可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組Viminten陽性斑點數無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組Viminten陽性斑點數顯著降低(P<0.05)。

圖4 細胞運動相關蛋白檢測結果

2.5微管形成實驗結果及VEGF表達情況 由圖5A可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組節點數目無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L 組節點數目顯著降低(P<0.05)；由圖5B可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組VEGF蛋白表達水平及VEGF mRNA表達無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L VEGF蛋白表達水平及VEGF mRNA表達顯著降低(P<0.05)。

圖5 微管形成實驗結果及VEGF表達情況

2.6凋亡相關蛋白表達結果 由圖6可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組Bax、Bcl-2、cytochrome C、PARP和cleaved PARP蛋白表達水平無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組Bax、cytochrome C、PARP和cleaved PARP蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖6 凋亡相關蛋白表達結果

3 討論

血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能特異性作用于血管內皮細胞，并促進血管內皮細胞增殖，其在胚胎發育、創傷愈合、腫瘤生長及轉移過程中發揮重要作用[7]。王文廉等[8]研究表明VEGF可引起血管內皮細胞的分裂、增殖及遷移，從而促進腫瘤細胞的進一步生長。本研究表明，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組VEGF蛋白表達水平及VEGF mRNA表達無顯著變化，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組VEGF蛋白及mRNA表達顯著降低。EDU染色結果顯示，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細胞陽性細胞數目無顯著變化，順式阿曲庫銨10 μmol/L組陽性細胞數目顯著降低。平板克隆實驗結果分析顯示，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細胞克隆形成率無顯著變化，順式阿曲庫銨10 μmol/L組細胞克隆形成率顯著降低。提示順式阿曲庫銨可有效降低乳腺癌MCF-7細胞的增殖能力，但當順式阿曲庫銨劑量低于5 μmol/L時作用效果并不明顯。宋瑩等[9]研究表明，抑制VEGF-A表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲與轉移，與本研究結論一致。

細胞的侵襲和遷移受上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)調節[10-11]。EMT是指上皮細胞能暫時喪失細胞極性獲得間質細胞移動能力。腫瘤細胞能夠通過細胞極性喪失改變自身細胞形態與其他細胞分離[12-13]；N-鈣黏蛋白(N-cadherin，CDH2)也稱為鈣黏著蛋白-2或神經鈣黏著蛋白，是人體由CDH2 基因編碼的蛋白質。N-鈣黏蛋白是在多種組織中表達并起到介導細胞-細胞黏附功能的跨膜蛋白。付麗梅等[14]研究表明，N-cadherin陽性表達率與癌的浸潤深度、分化程度、轉移呈正相關，且隨著癌癥轉移的發生N-cadherin蛋白表達量顯著增加。唐瑩等[15]研究表明，Vimentin是一種間質細胞來源的骨架蛋白，在維持間質細胞特性中起關鍵作用。其研究還表明，Vimentin表達出現異常時，細胞骨架蛋白的構成也會發生顯著改變，這種改變會導致正常上皮細胞變成纖維狀且易于游動遷移，促使細胞的侵襲、遷移能力增強。EMT晚期時Vimentin表達量通常會顯著強加，這也是EMT晚期的顯著標志之一[16]。本研究表明，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組E-cadherin N-cadherin蛋白表達及Viminten陽性斑點數無顯著變化，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組N-cadherin蛋白表達及Viminten陽性斑點數顯著降低，E-cadherin蛋白表達顯著升高。同時Transwell結果及劃痕實驗結果也表明使用10 μmol/L順式阿曲庫銨后乳腺癌MCF-7細胞的侵襲及遷移能力顯著降低。這可能是由于順式阿曲庫銨可通過抑制乳腺癌細胞的EMT過程增強細胞間的黏附能力，阻止腫瘤細胞運動，從而達到抑制乳腺癌細胞擴散的效果。郭昭澤等[17]研究表明，調節EMT過程可使乳腺癌細胞的侵襲及遷移能力減弱，與本研究得出的結論一致。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved-PARP，c-PARP)是一種與DNA損傷修復及細胞凋亡密切相關的酶[18]。PARP影響細胞凋亡與Caspase 家族的凋亡執行因子Caspase-3密切相關[19]。當細胞凋亡啟動時會激活Caspase-3，將PARP剪切成 85 kD 和 31 kD 2個片段，破壞PARP與DNA 的相互作用可導致PARP的靶蛋白Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶活性增強，促使DNA裂解，最終導致細胞凋亡。除了Caspase家族基因可以調控凋亡外，Bcl-2 家族的基因也是常見的凋亡控制基因。Bcl-2 家族主要通過Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達量觀察細胞是否凋亡[20-22]。Bax和Bcl-2表達呈相反趨勢，當Bcl-2表達下降時 Bax 表達上升，此時會促進細胞凋亡；當Bcl-2 表達升高，Bax表達降低時，則會抑制細胞凋亡。當細胞接收到凋亡信號后，Bax/Bcl-2比值升高，線粒體膜電位變化并最終提高線粒體外膜通透性，同時會將cytochrome C釋放至細胞質，并與 Apaf-1、procaspase-9形成復合體進而激活Caspase-3 進一步增強細胞凋亡過程[23-24]。本研究發現，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組Bax、Bcl-2、cytochrome C、PARP和cleaved PARP蛋白表達水平無顯著變化，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組Bax、cytochrome C、PARP和cleaved PARP蛋白表達水平顯著升高。流式細胞術和Hoechst 33342染色結果顯示，當順式阿曲庫銨處理濃度達到 10 μmol/L時，細胞凋亡率顯著升高，說明低劑量順式阿曲庫銨對乳腺癌MCF-7細胞凋亡影響較小，當處理劑量達到10 μmol/L時細胞凋亡率顯著升高。王瑩等[25]研究表明，通過促進線粒體凋亡途徑可有效促進乳腺癌細胞凋亡，與本研究結論一致。

綜上所述，順式阿曲庫銨可顯著抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖、侵襲及遷移并促進其凋亡。其作用機制可能與抑制細胞EMT過程并促進細胞凋亡因子Bax及Caspase家族凋亡因子相關，且在低劑量時作用效果不顯著，當劑量超過10 μmol/L時，效果顯著。本研究未涉及體內實驗，計劃在后續實驗中將乳腺癌MCF-7細胞注射至小鼠體內，在小鼠體內進行成瘤實驗，進一步探討順式阿曲庫銨在小鼠體內是否可以抑制乳腺癌細胞的增殖。