妊娠早期飼糧添加不同水平N-氨甲酰谷氨酸改善母羊產羔性能的研究

蔡 元，田見暉，王 棟，羅玉柱，翁士喬,李春陽

(1.西北民族大學生命科學與工程學院,蘭州 730030； 2.中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193；3.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193； 4.甘肅農業大學動物科學技術學院,蘭州 730070；5.寧波三生生物科技有限公司, 寧波 315100)

綿羊(Ovisaries)產羔數是影響養羊業發展的關鍵因素，產羔數的增加對于養羊經濟效益的提高具有重要意義。胚胎產前損失是哺乳動物繁殖過程中的一個主要問題，綿羊和大多數哺乳動物胚胎死亡率約20%～40%，其中三分之二發生在附植期[1]。目前，尚無有效方法減少早期妊娠胚胎損失，嚴重制約了家畜繁殖性能的發揮。母體營養是影響子宮內環境的主要因素，在調節胎兒存活、生長和發育中起重要作用。其中，營養的均衡性和質量都可能影響到胚胎發育。研究表明，精氨酸是體內合成一氧化氮(nitric oxide，NO)、蛋白質等物質的前體，能夠調控胎盤的營養運輸，促進胎盤和胎兒發育[2]，精氨酸通過內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)合成的NO對胚胎發育、著床和滋養層侵入、胎盤血管生成具有積極的調控作用[3-7]。鑒于精氨酸對胚胎發育的重要促進機制，很多研究在飼料中添加N-乙酰谷氨酸(N-acetylglutamate，NAG)的類似物[8]N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamate，NCG)，以激活精氨酸內源合成的必需輔助因子氨甲酰磷酸合成酶-Ⅰ(Carbamyl phosphate synthetase Ⅰ,CPS-Ⅰ)，促進精氨酸內源合成[9]。通過妊娠飼糧中添加NCG提高了胚胎存活率，顯著改善了母豬繁殖性能[10-11]，NCG還能降低過高血漿氨導致的胚胎和胎兒死亡風險[12]。有研究曾對限飼母羊補飼NCG，使胎盤肉阜和子葉組織中Tie-2 mRNA表達量、p-p70S6K蛋白表達量和臍靜脈血中的NO濃度顯著升高，進而促進了胎盤生長發育[13]，NCG添加還促進了營養不良母羊的胎兒生長[14-15]，但目前還未見母羊妊娠早期飼喂NCG效果的相關報道。為此，本研究擬在經產母羊妊娠早期飼糧中添加不同水平NCG，探索其對產羔性能的影響，以期為提高養羊業經濟效益提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

NCG的有效含量為97%，由國家飼料工程技術研究中心生產。

1.2 試驗動物與試驗設計

選擇160只2～3歲、胎次(2～3胎)和體重相近(約60 kg)、繁殖機能正常的湖羊母羊，隨機分為4組， 每組40只，每只母羊為1個重復。參照NRC(2004)標準，根據相應體重母綿羊妊娠前期營養需要量配制基礎飼糧(表1)。精料和粗飼料混合飼喂，對照組每只羊每天飼喂2.7 kg，其中精料0.162 kg、大麥草0.621 kg、苜蓿草0.135 kg、玉米青貯1.782 kg。以飼喂基礎飼糧的為對照組，飼喂在基礎飼糧中分別添加0.05%、0.08%和0.11%NCG的為試驗組。配種公羊為澳洲白，母羊采用同期排卵-子宮角定時輸精方式配種，腹腔鏡子宮角輸精1次，自配種當天(計為妊娠第0天)開始進行飼喂試驗，飼喂40 d后，各組均飼喂基礎飼糧，直到分娩。

表1 飼糧組成和營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of diets (dry matter basis) %

1.3 飼養管理及樣品采集

試驗在甘肅武威普康集團進行。各組根據試驗設計飼喂日糧，每天分08:30和16:00兩次飼喂。保證舍內清潔干燥、通風良好、溫度適宜，并進行常規清潔和定時消毒。在妊娠第0、20、40天上午8:00，每組選擇10只母羊空腹頸靜脈采血10 mL，置于有肝素鈉的離心管內，混勻，靜置20 min，4 ℃ 3 000×g離心10 min分離血漿樣品，將血漿分裝于1 mL的離心管，-20 ℃凍存，用于測定血漿中氨基酸、尿素、TNOS、iNOS、NO、生長激素、雌二醇、孕酮和氨的濃度。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 母羊產羔性能 記錄窩產羔羊數、窩產活羔數、死羔數、羔羊初生重等指標。

1.4.2 血漿氨基酸濃度的測定 采用德國賽卡姆Sykam(S-433D)(德國賽卡姆公司)氨基酸自動分析儀，測定血漿氨基酸濃度。取0.5 mL血漿樣品與10%磺基水楊酸按1∶3 比例稀釋，高速振蕩1 min， 冰上靜置 15 min，4 ℃ 10 000×g離心15 min， 取上清液過濾裝瓶,上機測定氨基酸濃度。

1.4.3 血漿TNOS、iNOS、NO、氨、尿素、生長激素、雌二醇和孕酮濃度的測定 用比色法測定TNOS、iNOS、NO、尿素和氨的濃度，用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定生長激素、雌二醇和孕酮濃度，均按試劑盒操作說明進行各指標測定。TNOS、iNOS、NO和氨試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；尿素、生長激素、雌二醇和孕酮檢測試劑盒均購自江蘇寶萊生物科技有限公司。

1.5 數據處理

剔除試驗期間掉栓、返情、空懷的試驗羊，4個處理組實際分娩母羊的數量分別為22、21、22和22只。 用SPSS 23.0統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05作為顯著性判斷標準，所有數據均以“平均值±標準誤”表示。

2 結 果

2.1 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊產羔性能的影響

如表2所示，與對照組相比，添加0.08%和0.11%NCG組，母羊窩產羔分別提高0.64(P<0.05)和0.59只(P<0.05)；窩產活羔數分別提高0.59(P<0.05) 和0.68只(P<0.05)；活羔初生個體重分別減少0.73(P<0.05)和0.78 kg(P<0.05)，但活羔初生窩重提高不顯著(P>0.05)。對照組2只母羊各產1只死胎，0.08%NCG組1只母羊產3只死胎。說明妊娠早期添加0.08%和0.11%NCG，能顯著增加湖羊窩產羔數，改善湖羊產羔性能。

表2 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊產羔性能的影響Table 2 Effects of different dietary NCG supplementation on the lambing performance of ewes during early pregnancy

2.2 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿游離氨基酸濃度的影響

如表3所示，添加NCG對妊娠20和40 d母羊血漿游離氨基酸濃度影響不顯著(P>0.05)，但血漿精氨酸濃度隨NCG增加呈逐漸升高趨勢;妊娠40 d時，血漿脯氨酸濃度隨NCG添加量增加呈升高趨勢。說明綿羊妊娠早期飼糧中添加NCG后血漿精氨酸和脯氨酸濃度有逐漸升高趨勢。

表3 妊娠早期飼糧中添加NCG 對母羊血漿游離氨基酸濃度的影響Table 3 Effects of different dietary NCG supplementation on the concentration of free amino acids in plasma of ewes during early pregnancy mol·L-1

2.3 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿NO、TNOS、iNOS濃度的影響

如表4所示，妊娠第40天時，0.05%、0.08%和0.11%NCG組NO濃度顯著高于對照組(P<0.05)，各添加組間差異不顯著(P>0.05)；0.05%、0.08%和0.11%NCG組TNOS濃度比對照組高，但差異不顯著(P>0.05)；0.11%NCG 組的iNOS濃度顯著高于對照組(P<0.05)，其余各組差異不顯著(P>0.05)。說明妊娠早期添加0.11%NCG，能夠顯著增加妊娠第40天綿羊血漿NO和iNOS的濃度。

表4 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿NO、TNOS、iNOS濃度的影響Table 4 Effects of different dietary NCG supplementation on the concentrations of NO，TNOS and iNOS in plasma of ewes during early pregnancy

2.4 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿激素濃度的影響

如表5所示，添加NCG對生長激素和雌二醇影響不顯著(P>0.05)； 0.11%NCG組妊娠第20天孕酮濃度比對照組高223.41 pmol·L-1(P<0.05)，其余各組間孕酮濃度差異不顯著(P>0.05)。說明妊娠早期添加0.11%NCG，能夠顯著增加妊娠第20天綿羊血漿孕酮的濃度。

表5 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿激素濃度的影響Table 5 Effects of different dietary NCG supplementation on the concentrations of hormone in plasma of ewes during early pre-gnancy

2.5 妊娠早期飼糧中添加NCG對母羊血漿尿素和氨濃度的影響

如表6所示，添加NCG對血漿尿素濃度影響不顯著(P>0.05)，0.08%和0.11%NCG組，妊娠第20天氨濃度顯著低于對照組和0.05%NCG組(P<0.05)，0.11%NCG組妊娠第40天血氨濃度顯著低于對照組(P<0.05)，其余各組間差異不顯著(P>0.05)。說明妊娠早期添加NCG，能夠顯著降低妊娠第20天0.08%和0.11%NCG組及妊娠第40天0.11%NCG組綿羊血漿氨的濃度。

表6 妊娠早期飼糧中添加NCG 對母羊血漿尿素和氨濃度的影響Table 6 Effects of different dietary NCG supplementation on the concentrations of urea and ammonia in plasma of ewes during early pregnancy

3 討 論

3.1 添加NCG對母羊產羔性能的影響

本研究表明，妊娠早期添加NCG，能增加母羊窩產羔數、窩產活羔數，改善湖羊產羔性能。母體營養是影響子宮內環境最主要的因素，母體營養不足和營養過剩都會降低胎盤-胎兒血流量，影響胎兒的生長發育和存活[16]，尤其在著床期和胎盤發育期，胎兒發育最容易受到蛋白質缺乏的影響，適宜的營養是提高胚胎存活率和促進胎兒生長發育的首要因素[10,17]。NCG作為精氨酸內源合成關鍵酶CPS-Ⅰ的激活劑，在體內能促進精氨酸合成，在動物機體中發揮多種有益作用，如促進血管生成、改善氮代謝、促進泌乳和生長、增強動物繁殖和免疫能力[18]，尤其是能促進綿羊滋養外胚層細胞系增殖、遷移和蛋白質合成[19-20]，減少多胎母羊胚胎損失，增加羔羊出生體重，提高胎羔成活率[21-22]。經產母豬整個妊娠期飼糧添加0.1%NCG，窩產活仔數提高0.55頭，仔豬初生窩重提高1.39 kg，初生個體重提高70 g，90 d血漿脯氨酸濃度顯著升高[12]，妊娠早期母豬飼糧添加NCG，顯著增加了窩產活仔數[11]。本試驗首次在湖羊妊娠早期添加NCG，也顯著改善了母羊產羔性能。

此外，本研究中添加NCG雖然提高了窩重，但0.08%和0.11%NCG組活羔初生個體重顯著降低，主要原因是添加NCG使產羔數顯著增加,由于總營養的限制性和個體的營養競爭作用，導致活羔初生個體重顯著降低；同時，經產母豬中一般在整個妊娠期[12]或妊娠后期[23]添加NCG，增加了仔豬數量，促進了胎兒的發育，本研究為減少早期妊娠胚胎損失，提高綿羊的產羔性能，在妊娠早期添加NCG，活羔初生個體重在3.6 kg以上，達到了一般羊場羔羊初生重為1.8 kg以上的健康標準。

3.2 添加NCG對母羊血漿NO和iNOS濃度的影響

本研究發現，0.05%、0.08%、0.11%NCG組在妊娠第40天時血漿NO顯著升高，有研究報道，添加NCG提高了妊娠母豬血漿NO含量[2, 12, 23]，限飼母羊補飼0.1%NCG使臍靜脈血中的NO濃度顯著升高，進而促進了胎盤生長發育[13]，和本研究結果一致。動物體內的NO是由精氨酸在NOS參與下合成[3]，NO是一種重要的內皮源性舒張因子，通過調控胎盤-胎兒間血流，在母體向胎兒提供養分和氧氣的過程中發揮重要的調控作用[24]，還通過重構細胞外基質調節胚胎著床[25]，為胎兒在子宮中的發育提供大量營養素[26]，在胎盤血管發育中起重要作用[4]，血管生成的起始需要VEGF的表達[27]，其有絲分裂效應由NO介導[28-29]，NO可誘導來自不同血管床的胎兒內皮細胞增殖[30-31]，并調節中心血管口徑[32]。大量的證據表明，NO是胎盤血管生成、胚胎發育以及胎盤和胎兒生長的重要調控因子[27-32]。妊娠早期NO濃度升高促進了胎盤發育，同時也提高了胚胎的存活和著床率，這可能是妊娠早期添加NCG增加綿羊產羔數的作用機理。妊娠0～28 d的母豬飼糧添加NCG，促進了胚胎存活和發育，使妊娠第28天的總胎和活胎數顯著增加，死亡率顯著降低[10]，這一結果支持了本試驗對產羔數增加作用機理的推測。此外，Liu等[33]研究表明，NCG可能通過microRNAs調控NOS和血管內皮生長因子等活性，這進一步印證了本試驗中添加NCG提高iNOS濃度的結果，也為本研究結果給出了科學合理的解釋。

3.3 添加NCG對母羊血漿激素水平的影響

雌激素和孕激素是調控妊娠的主要激素，它們在卵細胞的生殖道轉運、內皮細胞增殖和分化、子宮內皮細胞蛻膜化以及在胚胎著床過程中，都扮演著重要的調控角色，對哺乳動物妊娠的建立和維持起著至關重要的作用。本試驗在妊娠早期飼糧中添加NCG，提高了妊娠第20天的血液孕酮濃度，尤其0.11%NCG組在妊娠第20天的血漿孕酮顯著增加，因精氨酸也是一種激素促分泌素，能夠促進胰島素、生長激素等激素的合成與分泌[26, 34]。妊娠初期，孕激素能促進子宮內膜增生，使腺體發育、功能增強，從而有利于胚胎附植[35]，此階段孕酮濃度的升高，可能也是添加NCG增加產羔數的原因之一。

3.4 添加NCG對母羊血漿氨濃度的影響

經產母豬整個妊娠期飼糧中添加0.1%NCG后，血漿尿素和氨濃度降低[12]，本試驗中添加NCG組母羊血漿尿素濃度沒有明顯變化，其原因可能是物種不同。在飼糧中添加NCG能夠提高中國荷斯坦奶牛產奶量、顯著增加血漿NO水平、降低血漿氨水平、提高氮的利用率[36]。在人類醫學中，NCG已被應用于臨床進行代謝疾病的治療，用NCG處理后，血漿氨和谷氨酰胺水平明顯降低[37]，血漿氨濃度降低有利于胚胎和胎兒的存活[12]。本試驗中添加NCG也降低了母羊血漿氨濃度，說明綿羊飼糧中添加NCG提高了氮的利用率，也為胎兒提供了更安全的發育環境。

4 結 論

妊娠早期母羊飼糧添加NCG可提高母羊體循環iNOS、NO和孕酮濃度，改善胎盤營養與妊娠維持狀態；降低血漿氨濃度，提高胎兒發育環境安全性，改善母羊產羔性能，提高母羊窩產羔數和窩產活羔數。