沙棘籽蛋白質(zhì)分級提取及其氨基酸組成研究

王 晴，臧 鳳，錢玉梅，李紅俠，曹穩(wěn)根

沙棘屬胡頹子科，是我國傳統(tǒng)的可藥食兩用的植物，屬于國家食品藥品監(jiān)督管理總局列出的既是食品又是藥品的物品［1］.沙棘中富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，包括總黃酮、維生素、有機酸、甾體、多酚等，具有抗氧化、提高免疫力、抑菌等多種生物活性［2］.沙棘籽是沙棘生產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，約含有20%以上的蛋白質(zhì)，且包括多種氨基酸，具有極高的應(yīng)用前景［3］.本文以沙棘籽為原料，提取總蛋白，并同時進行分級分離得清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，探究總蛋白及各分級蛋白的蛋白含量、氨基酸組成，并對其分子量進行分析，為資源的有效利用及沙棘籽的綜合開發(fā)開辟有效途徑.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

野生沙棘果，采摘于山西交城龐泉溝自然生態(tài)保護區(qū)；牛血清蛋白，購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Marker 蛋白，購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；透析袋（截留相對分子量為8 000～14 000 Da）、石油醚、乙醇、鹽酸、考馬斯亮藍R250、考馬斯亮藍G250、Bis、甘氨酸、甲醇等，購于國藥集團化學試劑有限公司.

冷凍干燥劑（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；R-1001LN 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SP-723 型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；L-8800 氨基酸全自動分析儀（日立公司）等.

1.2 實驗方法

（1）沙棘籽脫脂粉的制備.新鮮沙棘果去除果皮和果肉，取籽，清洗晾干后用粉碎機粉碎，石油醚浸泡籽仁粉24 h，抽濾，干燥，過80目篩，重復以上步驟三次，最后制成沙棘籽脫脂粉，低溫儲藏備用.

（2）沙棘籽總蛋白的制備.將沙棘籽脫脂粉按照料液比1∶16 加入去離子水于錐形瓶中，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH 至11，并在溫度為50 ℃的條件下攪拌浸提60 min，然后在4 000 r/min 的離心機下常溫離心20 min 并收集上清液，所得沉渣再提取一次，合并兩次離心的上清液，取上清液用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至5.5，再 以4 000 r/min 離心20 min 后將 所得沉渣水洗一次，將兩次溶液中和后蒸發(fā)濃縮、透析、冷凍干燥即得沙棘籽蛋白質(zhì)［4］.

（3）沙棘籽Osboren 分級分離.采用Osboren分級分離法［5］提取沙棘籽清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白.稱取適量沙棘籽仁脫脂粉，按照料液比1∶10 添加去離子水于錐形瓶中混合均勻，室溫下攪拌提取60 min，浸提液于3 500 r/min 的離心機下離心20 min，取上清液，蒸發(fā)濃縮冷凍干燥，所得樣品即為清蛋白；將所得沉淀繼續(xù)按照料液比1∶10 加入5% NaCl 溶液混合均勻，在室溫下攪拌提取60 min，浸提液于3 500 r/min 的離心機下離心20 min，取上清液，在40 ℃條件下置于去離子水中透析72 h，每4 h 換一次去離子水，然后濃縮冷凍干燥即為球蛋白；將所得沉淀繼續(xù)按照料液比1∶10 加入75%乙醇混合均勻，在室溫下攪拌提取60 min，浸提液于3 500 r/min的離心機下離心20 min，取上清液，蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，所得樣品即為醇溶蛋白；將所得沉淀繼續(xù)按照料液比1∶10 加入0.2% NaOH 溶液混合均勻，室溫下攪拌提取60 min，浸提液于3 500 r/min 的離心機下離心20 min，取上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后再進行冷凍干燥，所得樣品即為谷蛋白.

（4）蛋白含量測定.考馬斯亮藍G250 100 mg，溶于50 mL 體積分數(shù)95%乙醇中，加入85%的磷酸100 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL；牛血清蛋白10 mg，溶于蒸餾水定容至100 mL，制成0.1 mg/mL 的標準蛋白溶液；取7 只試管，分別加入標準蛋白、水和考馬斯染液，即用0.1 mg/mL的標準蛋白溶液給各個試管分別加入0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL，然后用去離子水補充到1 mL，再分別加入5 mL考馬斯亮藍染液，每加完一管，立即振蕩使其充分混合，依次將7 只試管內(nèi)的溶液加入比色皿中，測定波長在595 nm 處的吸光值，其中1號試管作為空白，測得的吸光值清零，然后依次測定其他試管，以標準蛋白質(zhì)含量為橫坐標，以吸光度595 nm 為縱坐標，繪制標準曲線；取冷凍干燥后的樣品，用緩沖液溶解、稀釋，取稀釋樣液1 mL，加入5 mL 考馬斯亮藍染液，充分混合，再倒入比色皿中，在595 nm下進行比色，記錄吸光值A(chǔ)，以標準曲線1 號試管作空白，經(jīng)過換算得到樣品中的蛋白質(zhì)含量［6］.

（5）氨基酸組成與含量的測定.樣品的前處理采用酸水解法，所以氨基酸含量測定中色氨酸含量未能檢測.因為在強酸水解過程中，色氨酸與含醛基化合物作用產(chǎn)生黑色物質(zhì).取適量樣品于水解管中，加入一定量6 mol/L的HCl 溶液，抽真空，并在真空狀態(tài)下進行封口，將真空封口的水解管在110 ℃下水解24 h后取出冷卻，并用去離子水定容，將定容后的溶液過濾、蒸干，再加入0.02 mol/L 的HCl 溶液在空氣中放置30 min，測定組成及含量［7］.

（6）SDS-PAGE 電泳.采用SDS-PAGE 不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進行電泳.聚丙烯酰胺凝膠具有分子篩效應(yīng)，能夠根據(jù)蛋白質(zhì)中分子量的形狀、大小及所帶電荷量的區(qū)別而有規(guī)律地分開.此次試驗使用垂直板電泳槽，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，采用考馬斯亮藍R250 染色，脫色，分析［8］.

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

本次試驗所得數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差的形式進行表示.

2 結(jié)果與討論

2.1 總蛋白及各分級蛋白含量

沙棘籽脫脂粉中總蛋白及各分級蛋白含量如表1 所示，結(jié)果顯示，沙棘籽中蛋白質(zhì)含量豐富，清蛋白含量最高，醇溶蛋白的含量最低，但總蛋白含量并不等于各分級蛋白含量，表明沙棘籽總蛋白中還含有其他類型的蛋白質(zhì)未用Osboren 分級分離提取出來，仍殘留于沉淀中.清蛋白和球蛋白具有較好的溶解性，決定沙棘籽蛋白具有良好的功能特性，為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ).

表1 沙棘籽各蛋白組分的含量/（g/100 g 脫脂粉）

2.2 氨基酸組成分析

（1）必需氨基酸及非必需氨基酸的組成及含量.如表2 所示，沙棘籽蛋白質(zhì)中氨基酸含量豐富，種類齊全，除谷蛋白外，其余各蛋白中谷氨酸所占比例最高.谷氨酸在自然界中普遍存在，其在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中具有重要意義，不僅可以改善兒童智力發(fā)育，還能作為營養(yǎng)藥物用于皮膚和毛發(fā)，有較高的營養(yǎng)價值.谷氨酸廣泛用于調(diào)味劑、鮮味劑，有增香作用，可用于增強食品風味［9］.沙棘籽總蛋白中纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸，清蛋白中纈氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，球蛋白中纈氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸含量均高于FAO/WHO 推薦模式中成人對氨基酸的需求.在非必需氨基酸中，清蛋白各氨基酸含量均為最高，且均高于其他蛋白各氨基酸含量，由此可見，沙棘籽蛋白質(zhì)具有較高的營養(yǎng)價值.

表2 沙棘籽蛋白組分中氨基酸的組成和含量/（g/100 g 蛋白）

（2）不同種類氨基酸的分布.按照不同氨基酸的化學性質(zhì)對各蛋白組分中的氨基酸歸類，通過計算，得到不同類型氨基酸的分配比例，結(jié)果如表3 所示.清蛋白中非極性氨基酸、極性氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸、中性氨基酸、芳香族氨基酸、含硫氨基酸的含量均為最高，球蛋白中芳香族氨基酸含量最高，且清蛋白中極性氨基酸含量最高，其余均是中性氨基酸含量最高.

（3）特殊氨基酸的含量.如表4 所示，清蛋白中支鏈氨基酸含量最高，支鏈氨基酸是機體合成蛋白質(zhì)的原料，同時也是一種重要的運動營養(yǎng)補劑.近年來，通過研究發(fā)現(xiàn)，支鏈氨基酸具有抗衰老的功能，可影響機體蛋白質(zhì)的分解和合成，還能夠提高機體免疫力，對機體具有重要作用.甜味氨基酸在清蛋白中含量最高；鮮味氨基酸在清蛋白中的含量遠高于其他蛋白.

2.3 SDS-PAGE 電泳分析

從圖1 可以看出，沙棘籽各蛋白組分的分子質(zhì)量分布廣泛，條帶較多.清蛋白約有14 條譜帶，主要條帶比較集中地分布于14.3～44.3 kDa；球蛋白大約有16 條譜帶，高分子質(zhì)量條帶比清蛋白多，主要條帶分布與清蛋白相近，這是因為采用傳統(tǒng)的Osboren 分級分離方法難免會造成清蛋白和球蛋白的相互污染，可能造成條帶相混；谷蛋白主要有9 條譜帶，而且條帶較淺，這可能與其溶解性較低、不易于溶解到凝膠中有關(guān)；醇溶蛋白沒有清晰明顯的電泳條帶，可能與它溶解性較差、純度較低有關(guān)，可見，沙棘籽各蛋白組分亞基組成比較復雜，由多種具有不同分子量的亞基組成.

表3 沙棘籽蛋白組分中不同類氨基酸的構(gòu)成分布/（g/100 g 蛋白）

表4 沙棘籽組分中特殊氨基酸含量/（g/100 g 蛋白）

圖1 沙棘籽不同蛋白組分的SDS-PAGE 電泳圖

3 結(jié)論

本文以沙棘籽為原料，提取總蛋白，并通過對沙棘籽分級分離得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，測出各蛋白組分中蛋白質(zhì)含量，進行氨基酸組成分析、SDS-PAGE 電泳，表明沙棘籽中蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸種類齊全，必需氨基酸含量均遠遠高于FAO/WHO 推薦模式中成人對氨基酸的需求，其中清蛋白是最主要的蛋白質(zhì)類型，其各類氨基酸含量均為最高.由此可見，沙棘籽蛋白是一個氨基酸含量豐富、種類齊全、值得開發(fā)和利用的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其發(fā)展前景十分樂觀，且對沙棘籽的有效開發(fā)及資源的充分利用具有極其深遠的意義.