斑點叉尾鮰魚下腳料蛋白提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化研究

陳紫紅，黃茂坤

我國水產(chǎn)養(yǎng)殖居世界前列，2019 年全國水產(chǎn)品產(chǎn)量高達(dá)6 450 萬噸［1］.在水產(chǎn)加工過程中出現(xiàn)大量的下腳料，約占魚體質(zhì)量的70%，這些魚頭、魚皮等下腳料含有豐富的膠原蛋白，大多被丟棄，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染［2］.斑點叉尾鮰魚（Channel Catfish）富含蛋白質(zhì)和多種不飽和脂肪酸，具有增強(qiáng)免疫力和降血脂等功效［3］.冷凍魚片是目前絕大多數(shù)鮰魚進(jìn)行初加工的方式，但這種加工方式會產(chǎn)生大量的下腳料，致使資源浪費和生產(chǎn)成本提高［4］.

大量實驗表明，水產(chǎn)品的蛋白含量豐富，其在抑菌、抗氧化以及抗疲勞等方面作用顯著［5-7］.目前常用的提取蛋白方法主要有超聲輔助法、酶法、堿提酸沉法等，其中，堿提酸沉法易于操作且所需儀器設(shè)備簡單，更適用于水產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)［8-10］.

利用蛋白易溶于堿性溶液從而提高蛋白提取率的特點，本研究采用堿提酸沉法提取鮰魚下腳料蛋白，以蛋白提取率為指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法的中心組合設(shè)計優(yōu)化提取蛋白的工藝條件，建立提取工藝與鮰魚蛋白提取率之間的數(shù)學(xué)模型，以期獲得最優(yōu)的蛋白質(zhì)提取工藝參數(shù)，旨在為斑點叉尾鮰魚下腳料的高值化利用及相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮斑點叉尾鮰魚購于泉州市豐澤區(qū)石頭街菜市場；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)均購于上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、磷酸和氫氧化鈉等試劑均為分析純，購自西隴化工股份有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

ME 型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PE20 型pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H1650 型臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DS-7510DT 超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司.

1.3 實驗方法

（1）蛋白提取.將鮰魚下腳料進(jìn)行凍干粉碎后，將凍干魚粉按照一定的比例配成溶液，調(diào)節(jié)堿性pH，置于恒溫振蕩器中反應(yīng)一定時間，取出離心，在8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，調(diào)節(jié)pH 至蛋白質(zhì)等電點4.0，靜置12 h 離心取沉淀，低溫烘干測定蛋白含量.

（2）蛋白含量的測定.選用凱氏定氮法測定鮰魚蛋白質(zhì)的含量［11］，選用考馬斯亮藍(lán)法測定粗提液中的蛋白質(zhì)含量［12］.

（3）單因素實驗.以蛋白提取率為指標(biāo)，分別考察料液比、堿提pH 和堿提溫度對鮰魚蛋白提取率的影響，考察各因素影響的顯著性及最優(yōu)水平.

①料液比對鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.稱取魚粉，分別按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 至10，置于恒溫振蕩器中，在50 ℃下反應(yīng)2 h 后，取出反應(yīng)液，在8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液調(diào)節(jié)pH 至4.0，靜置12 h 離心取沉淀，低溫烘干測定蛋白含量.

②堿提溫度對鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.稱取魚粉，按照1∶20 的料液比配成提取液，調(diào)節(jié)pH 至10，分別置于恒溫振蕩器中，在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下反應(yīng)2 h后，取出反應(yīng)液，在8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液，調(diào)節(jié)pH 至4.0，靜置12 h 離心取沉淀，低溫烘干測定蛋白含量.

③堿提pH 對鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.稱取魚粉，按照1∶20 的料液比加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 分別至9、10、11、12、13，置于恒溫振蕩器中，在50 ℃下反應(yīng)2 h 后，取出反應(yīng)液，在8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液調(diào)節(jié)pH 至4.0，靜置12 h 離心取沉淀，低溫烘干測定蛋白含量.

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的因素，采用Design-Expert 8.0 軟件的Box-Behnken 方法設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化實驗，建立各因素及其交互作用與蛋白提取率之間的數(shù)學(xué)模型，探討料液比（A）、堿提pH（B）、堿提溫度（C）及其交互作用對蛋白提取率的影響，尋找最優(yōu)的蛋白提取工藝，實驗因素與水平見表1.

表1 中心組合實驗因素水平編碼表

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用楊正坤等人［13］的研究方法進(jìn)行牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作.以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得線性回歸方程為y=1.882 9x+0.260 6（R2=0.992 9）.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

文中所有數(shù)據(jù)均取三次重復(fù)實驗的平均值，采用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Origin 7.5 軟件作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

（1）料液比對于鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.料液比對鮰魚下腳料的蛋白提取率影響如圖1 所示.

圖1 料液比對鮰魚下腳料蛋白提取率的影響

由圖1 可知，當(dāng)料液比在1∶10 到1∶20 之間時，鮰魚蛋白的提取率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)料液比超過1∶20，蛋白提取率出現(xiàn)大幅降低后趨于平緩的趨勢.當(dāng)料液比低于1∶20 時，由于反應(yīng)液的濃度較大，分子間作用力增強(qiáng)，導(dǎo)致分子擴(kuò)散速率較低，影響反應(yīng)液中蛋白質(zhì)的溶出，降低了蛋白提取率［14］.當(dāng)料液比過大時，蒸餾水含量的增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)形成了一個水化層，使蛋白質(zhì)顆粒間隔距離增大，影響蛋白質(zhì)的沉淀效果，從而導(dǎo)致蛋白提取率的降低［15］.因此，料液比以1∶20為宜.

（2）堿提溫度對于鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.堿提溫度對鮰魚下腳料的蛋白提取率影響如圖2 所示.由圖2 可知，隨著溫度升高，鮰魚下腳料蛋白提取率也隨之增大，當(dāng)溫度超過40 ℃時，呈現(xiàn)明顯的下降趨勢.當(dāng)溫度低于40 ℃時，溫度較低，反應(yīng)速度較慢，隨著溫度的上升，分子間運動加劇，有效碰撞次數(shù)增多，反應(yīng)速率的提升導(dǎo)致提取率的上升，這與衛(wèi)萍等人［16］的研究結(jié)果是一致的.蛋白提取率在40 ℃時達(dá)到29.5%的最高值，當(dāng)溫度超過40 ℃時，高溫會破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)展開暴露，蛋白質(zhì)變性使提取率下降［17］.因此選取40 ℃為后續(xù)的堿提溫度.

圖2 堿提溫度對鮰魚下腳料蛋白提取率的影響

（3）堿提pH 對于鮰魚下腳料蛋白提取率的影響.堿提pH 對鮰魚下腳料的蛋白提取率影響如圖3 所示.由圖3 可知，鮰魚下腳料的蛋白提取率隨著堿提pH 的上升呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢.在堿提pH 為11 時，蛋白提取率高達(dá)65.48%.在堿 提pH 處于9～11 的 范圍時，提取率隨著堿提pH 的升高而升高，此時鮰魚蛋白中的負(fù)電荷在堿性條件下使得蛋白分子相互排斥，分散均勻，溶解度提高，致使提取率呈現(xiàn)上升的趨勢［18］，當(dāng)堿提pH 過高時，強(qiáng)堿會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或者過度水解，從而使蛋白提取率下降.因此，選取堿提pH為10、11、12 這三個水平進(jìn)行響應(yīng)面的優(yōu)化實驗.

圖3 堿提pH 對鮰魚下腳料蛋白提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗確定各因素的最佳范圍，采用Box-Behnken 中心組合設(shè)計3 因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，對影響鮰魚下腳料的蛋白提取率的3 個因素：料液比、堿提溫度和堿提pH 進(jìn)行響應(yīng)面實驗分析，響應(yīng)面分析及結(jié)果見表2.

表2 中心組合實驗設(shè)計結(jié)果

采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，結(jié)果見表3.該模型的P值<0.000 1，回歸模型顯示差異顯著，而失擬項的P值為0.305 6，大于0.05，表明失擬項不顯著，可用該模型預(yù)測分析實驗結(jié)果.模型的一次項和平方項極顯著（P＜0.01），交互項不顯著（P＞0.05），說明各因素的交互作用對鮰魚下腳料蛋白提取率影響不顯著.從表中F值可以看出，各因素對于提取率的影響為堿提pH>溫度>料液比；采用所建模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，相關(guān)系數(shù)R2=0.945 4 大于0.9，說明該回歸方程的相關(guān)度較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系相對顯著，斑點叉尾鮰魚下腳料蛋白提取后的提取率變化94.54%來源于所選變量；失擬項P>0.05，表明該回歸方程能夠較好地擬合真實的響應(yīng)面，可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化.

為了驗證模型的準(zhǔn)確性，采用所建模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析，得出斑點叉尾鮰魚下腳料的蛋白提取最優(yōu)工藝條件為料液比為1∶19.13、堿提pH 為11.39、堿提溫度為37.84 ℃，在該條件下預(yù)測的提取率為84.85%，為適應(yīng)具體操作，調(diào)整條件為料液比1∶20、堿提pH 11.4、堿提溫度38 ℃，驗證后的水解度為82%±0.34%，與預(yù)測值接近，可見該模型可用于實踐.

3 討論與結(jié)論

利用堿提酸沉法提取動物優(yōu)質(zhì)蛋白，耗時短且操作便捷，是蛋白提取的常用方式.有研究利用堿提酸沉法提取的如鰱魚［19］、羅非魚［20］、鵝肝［21］、磷蝦［22］等的蛋白質(zhì)，并對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)蛋白提取影響因素與本試驗基本一致，但不同動物源蛋白的最優(yōu)提取條件卻不盡相同，如鰱魚的最佳堿提pH 是12.0，而磷蝦的最佳浸提pH 是13.0.出現(xiàn)這種差別的原因可能是不同原料中的蛋白含量和性質(zhì)不同，從而影響蛋白提取條件.

斑點叉尾鮰魚在經(jīng)過切片加工后產(chǎn)生大量的下腳料被丟棄，綜合利用不充分，造成了環(huán)境污染和資源浪費，也導(dǎo)致了生產(chǎn)成本的增加.本試驗以斑點叉尾鮰魚下腳料為研究對象，蛋白提取率為指標(biāo)，從料液比、堿提pH和堿提溫度三個方面篩選出了斑點叉尾鮰魚下腳料蛋白提取的最佳工藝，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken 響應(yīng)面法優(yōu)化斑點叉尾鮰魚下腳料蛋白提取的工藝參數(shù)，建立了關(guān)于提取率的預(yù)測模型.結(jié)果表明：各因素對蛋白提取率的影響依次為堿提pH>堿提溫度>料液比，斑點叉尾鮰魚下腳料提取的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶20、堿提pH 11.4、堿提溫度38 ℃，在此條件下，斑點叉尾鮰魚下腳料蛋白質(zhì)提取率高達(dá)82%±0.34%.本提取工藝可為斑點叉尾鮰魚下腳料的高值化利用及附加產(chǎn)品的開發(fā)提供參考，為鮰魚的產(chǎn)業(yè)增值提供新的技術(shù)支持.