基于Nrf2/HO-1 通路比較雷公藤與及己根水提取物對(duì)大鼠的腎毒性

夏榮平，孫淑萍，張家豪，李佳榮，曹雯靜，許珊珊，靳珊珊

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）隸屬于衛(wèi)矛科雷公藤屬，其去皮后的根入藥可用于治療炎癥性疾病，臨床上常用于濕熱結(jié)節(jié)、關(guān)節(jié)炎和跌打損傷等疾病的治療［1］.臨床研究［2-3］表明，患者在服用雷公藤后出現(xiàn)一些明顯的不良反應(yīng)癥狀.主要特征為：胃腸道反應(yīng)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶明顯升高（約2 倍）、心血管疾病等.一些女性患者甚至出現(xiàn)了月經(jīng)紊亂、皮膚粘膜受損、脫發(fā).本課題組前期的研究［4］也證實(shí)了雷公藤提取物在一定的劑量范圍內(nèi)對(duì)大鼠腎臟具有明顯毒性作用，故需要嚴(yán)格控制其劑量，做好臨床監(jiān)測(cè)工作.

及己（Chloranthus serratus Roem.et Schult）隸屬于金粟蘭科金粟蘭屬，以其具有抗菌消炎、舒筋活絡(luò)等作用的根或全草入藥，可以治療風(fēng)濕疼痛及相關(guān)炎癥疾病［5］.及己既可以內(nèi)服也可以外用，但及己根有毒，過量服用會(huì)引起嘔吐、意識(shí)模糊、心外膜內(nèi)出血、肺出血及腎功能損傷等癥，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致死亡［6］.

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤和及己均能用于治療炎癥疾病，且都具有一定的腎毒性［4-5］.而目前有關(guān)雷公藤、及己的毒性報(bào)道多為肝毒性和心臟毒性，對(duì)腎毒性方面的研究相對(duì)缺乏.因此，本研究選擇了氧化應(yīng)激損傷和Nrf2/HO-1 信號(hào)通路作為雷公藤和及己根水提取物致?lián)p傷的切入點(diǎn)來比較兩者引發(fā)的大鼠腎毒性大小，從而推斷及己是否有替代雷公藤用于臨床治療的可能，也為后期醫(yī)療人員應(yīng)用及己治療相關(guān)炎癥疾病奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）主要儀器.酶標(biāo)儀（深圳山特電子有限公司）；顯微鏡（CKX3OLYMPUS，昆山諾普森實(shí)驗(yàn)室用品科技有限公司）；電泳儀（Biorad，深圳市宇德立生物科技有限公司）；自動(dòng)曝光儀（Amersham Imager 600，General Electric Company）；高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）等.

（2）藥材.試驗(yàn)藥材均為2013 年購自安徽亳州中藥材市場(chǎng)，符合《中國(guó)藥典》2015 版一部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).將中藥及己根與雷公藤清洗干凈，待風(fēng)干后粉碎成粗粉，室溫干燥保存.定量稱取雷公藤粗粉500 g，回流提取三次：分別用12 倍量水、10 倍量水、8 倍量水，提取1.5 h、1 h、1 h.將濾液合并，濃縮至黏稠狀，然后置于干燥箱（45 ℃），干燥好后粉碎過篩（80目），得雷公藤水提取物（LS）.及己根水提取物（GS）制備方法同上.藥物提取率（%）=水提取物重量（g）/粗粉重量（g）×100%.及己根、雷公藤的藥物提取率分別為14.2%、13.8%.

（3）試劑.尿酸（UA）、肌酐（CR）試劑盒（RCL0248、RCL0246，上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司）；尿素氮（BUN）試劑盒（2014007，長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（20190613、20190616，南京建成生物工程研究所）；核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）一抗（美國(guó)Proteintech公司，16396-1-AP）；鼠來源β-actin 一抗（批號(hào)：66240-1-LS）、HRP-羊抗鼠IgG（批號(hào)：BST12F21C50）、兔來源血紅素加氧酶-1（HO-1）一抗（批號(hào)：ZP1039BP39）、HRP-羊抗兔IgG（批號(hào)：BST12L05A54）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1一抗（批號(hào)：BST12F21C49），均買自武漢BOSTER生物工程有限公司.

（4）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.30 只SD 雄性大鼠，鼠齡為6 周，體質(zhì)量為（190±10）g.實(shí)驗(yàn)大鼠采購于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)：SCXK（魯）2014-0007.飼養(yǎng)環(huán)境：室溫、通風(fēng)、正常進(jìn)行飲食，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d.

1.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開始前，分別向兩組大鼠灌胃給予相應(yīng)濃度的藥物提取物（GS 溶液濃度為38.3 g/kg、LS 溶液濃度為37.3 g/kg）.如果大鼠未出現(xiàn)死亡，則另取2 只灌胃給予GS 溶液，2 只灌胃給予LS 溶液，觀察這些大鼠在48 h 內(nèi)的總體狀態(tài)變化和死亡率.

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)均分為3 組：空白（KB）組、及己根水提取物（GS）組和雷公藤水提取物（LS）組，每組10 只.按照人和動(dòng)物體表面積比值劑量表［7］和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定實(shí)驗(yàn)大鼠給藥劑量（提取物質(zhì)量，g/kg）為：成人給藥劑量3 g（原藥材）×換算系數(shù)（0.018）×藥材提取率（GS 提取率為14.2%，LS 提取率為13.8%）×倍數(shù)（100）×5；5 為200 g 大鼠用藥量轉(zhuǎn)化成1 kg 大鼠用藥量，即GS 組為3.83 g/kg、LS 組為3.73 g/kg.每天分別將及己根與雷公藤水提取物灌胃給予GS 組和LS 組大鼠，KB 組給予等量的蒸餾水，持續(xù)給藥兩周.

1.4 大鼠日常狀況觀察

每日給藥時(shí)通過觀察大鼠的毛色、進(jìn)食、進(jìn)水、日常活動(dòng)及精神等基本狀況，判斷其是否出現(xiàn)毒性癥狀，并從初次給藥之日起，隔日記錄一次各組大鼠的體重，計(jì)算出各組大鼠的體重變化率.體重變化率（%）=（實(shí)驗(yàn)開始后某一天的體重-第一天的體重）/第一天的體重×100%.

1.5 樣本的采集和腎功能檢測(cè)

給藥 第15 天，按0.4 mL/100 g 的 劑量，用25%烏拉坦溶液腹腔注射，使大鼠麻醉，進(jìn)行眼球取血.將取好的血液離心15 min（4 ℃、3 000 rpm），取其上清液，按照試劑盒說明書用酶標(biāo)儀測(cè)BUN、CR 和UA 含量.

取血后將大鼠處死并收集腎臟組織，洗凈吸干后稱重，計(jì)算腎臟系數(shù).腎臟系數(shù)（%）=腎臟質(zhì)量（g）/大鼠質(zhì)量（g）×100%.取大鼠左側(cè)腎臟組織，用10%甲醛溶液進(jìn)行固定后使用常規(guī)HE 染色并進(jìn)行病理檢查，其余保存在-80 ℃冰箱.

1.6 大鼠腎臟勻漿中MDA和T-SOD含量測(cè)定

取適量保存的腎臟組織復(fù)溫，按質(zhì)量體積比為1∶9 加入冰生理鹽水進(jìn)行勻漿.于4 ℃、2 500 rpm 下將腎臟組織勻漿液離心20 min.取上清液按相應(yīng)的試劑盒說明書測(cè)定MDA 和T-SOD 含量.

1.7 大鼠腎臟微結(jié)構(gòu)病變觀察

取1.5 中固定的腎臟組織，梯度乙醇進(jìn)行脫水，用石蠟進(jìn)行包埋制片（約5 μm）.將制好的切片進(jìn)行脫蠟、醇化、HE 染色，徹底脫水、透明及封片后于顯微鏡下觀察，以確定是否出現(xiàn)炎性細(xì)胞、血管擴(kuò)張充血和脂肪變性等病理學(xué)改變.

1.8 免疫組化法檢測(cè)大鼠腎臟中TGF-β1 陽性表達(dá)情況

將1.7 中制作的石蠟切片脫蠟、梯度乙醇復(fù)水、枸櫞酸熱修復(fù)、3% H2O2溶液滅活內(nèi)源性酶、血清封閉后，進(jìn)行一抗孵育過夜（4 ℃）和二抗孵育，滴加SABC 和顯色液，復(fù)染、封片.顯微鏡下觀察并拍照，選擇具有代表性的免疫組化圖片，采用Image J 軟件讀取三次免疫組化圖片的陽性表達(dá)百分率，并用SPSS 23.0軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.9 Western bloting 檢 測(cè)Nrf2/HO-1 通 路 蛋白含量

取適量1.5 中的腎臟組織，加入250 μL 裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），冰水浴研磨勻漿20 min 后離心20 min（4 ℃、12 000 rpm），收集上清液于EP 管中，進(jìn)行BCA 蛋白含量測(cè)定，加入4 倍體積的上樣緩沖液，然后于沸水浴中加熱進(jìn)行變性.以蛋白含量40 μg/孔，并在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳40 min 后110 V恒壓轉(zhuǎn)膜（NC 膜）70 min.將NC 膜用5%脫脂牛奶封閉2 h 之后一抗（Nrf2、HO-1、β-tubulin、β-actin）孵育過夜（4 ℃），清洗，孵育二抗2 h后滴加發(fā)光液曝光，用Image J 軟件獲取曝光后各條帶的灰度值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 23.0 軟件處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.單因素方差分析用于多組樣本之間均數(shù)的比較，采用LSD 進(jìn)行事后檢驗(yàn).P值小于0.05，表示具有顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

GS組和LS組大鼠的用藥量分別為3.83 g/kg和3.73 g/kg 時(shí)，不會(huì)造成大鼠死亡.同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GS 組和LS 組大鼠的LD50分別高于3.83 g/kg 和3.73 g/kg.因此，最終選擇GS 組3.83 g/kg 和LS 組3.73 g/kg 作 為 評(píng) 估GS、LS 致大鼠腎毒性大小的劑量.

2.2 大鼠日常狀況觀察

KB 組大鼠飲食規(guī)律、精神飽滿、毛發(fā)光滑有光澤；與KB 組相比，GS 組大鼠飲食、毛發(fā)未見明顯異常；LS 組大鼠飲食減少、精神萎靡、大便黏稠、有掉毛現(xiàn)象.

2.3 大鼠體重變化趨勢(shì)

從第3 d 到第15 d，KB 組大鼠體重增長(zhǎng)率高于GS 組和LS 組，且組間差距從第13 d 開始逐步增大.GS 組大鼠體重增長(zhǎng)較平穩(wěn)，但其體重變化率在實(shí)驗(yàn)后期較KB 組極顯著降低（P<0.01），LS 組體重增長(zhǎng)率后期較KB 組和GS 組極顯著降低（P<0.01），見圖1.

圖1 KB、LS、GS 組大鼠體重變化率曲線

2.4 對(duì)腎臟系數(shù)的影響

與KB 組相比，LS 組能誘導(dǎo)較GS 組更明顯的大鼠腎臟系數(shù)的上升（P<0.05），見圖2.

圖2 各組大鼠腎臟系數(shù)

2.5 對(duì)腎臟MDA 和T-SOD 含量的影響

與KB 組相比，LS 組大鼠T-SOD 含量的降低和MDA 含量的上升均較明顯（P<0.01）；GS組中T-SOD 和MDA 含量均降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1.

表1 大鼠腎臟勻漿中T-SOD 和MDA 含量（，n=10）

表1 大鼠腎臟勻漿中T-SOD 和MDA 含量（，n=10）

注：與KB 組相比，**P<0.01；與GS 組相比，##P<0.01.

組別KB LS GS劑量/（g·（kg·d）-1）/3.73 3.83 T-SOD/（U·mgprot-1）119.80±8.96 74.42±4.55**##118.96±5.29 MDA/（nmol·mgprot-1）2.50±0.18 5.78±0.32**##2.48±0.16

2.6 對(duì)血清中BUN、CR 和UA 含量的影響

與KB 組相比，LS 組和GS 組的CR 和UA水平均極顯著升高，而BUN 水平僅LS 組升高明顯（P<0.01）；與GS 組相比，LS 組UA 和BUN水平極顯著升高（P<0.01），見表2.

表2 大鼠血清中BUN、CR 和UA 的含量（，n=10）

表2 大鼠血清中BUN、CR 和UA 的含量（，n=10）

注：與KB 組相比，**P<0.01；與GS 組相比，##P<0.01.

組別KB LS GS劑量/（g·（kg·d）-1）/3.73 3.83 BUN/（mmol·L-1）5.76±0.94 16.90±1.00**##6.90±0.57 CR/（μmol·L-1）24.20±0.89 31.95±1.20**31.10±1.10**UA/（μmol·L-1）270.00±3.57 1 157.45±1.98**##398.00±5.95**

2.7 對(duì)腎臟組織形態(tài)的影響

顯微鏡下，KB 組組織結(jié)構(gòu)未觀察到明顯異常，毛細(xì)血管未見充血和擴(kuò)張，腎小球大小形狀也趨于正常；LS 組皮質(zhì)部分存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有水腫，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，腎小球呈現(xiàn)明顯擴(kuò)張狀態(tài)，甚至出現(xiàn)壞死溶解，髓質(zhì)部分血管擴(kuò)張充血嚴(yán)重；GS 組皮質(zhì)部分觀察到少許炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小囊內(nèi)伴有少量充血，髓質(zhì)部分可見少量毛細(xì)血管擴(kuò)張出血嚴(yán)重，見圖3.

圖3 大鼠腎臟HE 染色病理切片（×200）

2.8 對(duì)腎臟中TGF-β1的陽性表達(dá)的影響

TGF-β1的陽性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，黃染程度越深，面積越大，表明陽性表達(dá)越高.在腎臟髓質(zhì)部分和皮質(zhì)部分，與KB 組相比，LS 組和GS 組的黃染程度和面積都明顯增大（P<0.01），而LS 組較GS 組黃染程度也明顯加深（P<0.01）.見圖4.

圖4 大鼠腎臟中TGF-β1 陽性表達(dá)（×200）

2.9 大鼠腎組織Nrf2 和HO-1 蛋白的表達(dá)

與KB 組 相 比，LS 組Nrf2 和HO-1 蛋 白 表達(dá)水平降低明顯（P<0.01），而GS 組降低不明顯，見圖5.

圖5 大鼠Nrf2 和HO-1 蛋白含量表達(dá)

3 討論

中藥雷公藤和及己都可用于治療炎癥，但均有一定的腎毒性，同時(shí)及己根的毒性較莖和葉小［8］.目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道及己根和雷公藤水提取物的腎毒性比較研究，因此，及己根和雷公藤的腎毒性大小有待深入研究，以觀察及己是否具有進(jìn)一步的開發(fā)價(jià)值.

本研究中，大鼠的的體重變化情況和腎臟系數(shù)顯示，LS 組和GS 組大鼠體重增長(zhǎng)和腎臟系數(shù)上升均較KB 組低，表明這兩組大鼠的腎臟組織皆出現(xiàn)了毒性損傷.而與GS 組相比，LS 組大鼠體重和腎臟系數(shù)的變化更為明顯.從大鼠腎臟組織HE 染色的病理切片也可以看出，LS 組和GS 組大鼠腎小管皮質(zhì)部分已經(jīng)出現(xiàn)了炎細(xì)胞，且LS 組的髓質(zhì)部分?jǐn)U張出血更為嚴(yán)重，以上結(jié)果表明，LS 組大鼠的腎組織受損較重.

作為評(píng)價(jià)腎功能的常規(guī)指標(biāo)，血清CR 可以準(zhǔn)確反應(yīng)機(jī)體腎臟是否出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性受損，CR 值偏高，代表腎功能下降［9］.BUN 是衡量腎小球?yàn)V過功能的常規(guī)指標(biāo)，當(dāng)腎臟受損較嚴(yán)重或者受損時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，BUN 數(shù)值異常升高［10］.UA 含量與腎功能密切相關(guān)，腎損傷時(shí)則會(huì)應(yīng)激性升高［11］.當(dāng)患者的腎功能出現(xiàn)異常時(shí)，CR、BUN 和UA 的數(shù)值會(huì)表現(xiàn)出不同程度的升高.本研究中，GS 組BUN 含量無顯著上升，而CR 和UA 含量都極顯著性升高，而LS組三個(gè)指標(biāo)均極顯著性升高，表明LS 組引起了更為嚴(yán)重的腎毒性，該組大鼠腎損傷更加嚴(yán)重.

氧化應(yīng)激損傷與腎組織損傷息息相關(guān)，當(dāng)生物體內(nèi)活性氧（ROS）成分過多，生物體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡就會(huì)被打破.大量的ROS 會(huì)產(chǎn)生具有毒性作用的活性氧分子如羥基自由基和亞硝酸陰離子等［12］.脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA 是衡量機(jī)體氧化脅迫程度的常用指標(biāo)之一，過量的MDA 能導(dǎo)致膜脂過氧化，造成細(xì)胞膜損傷［13］.SOD 作為機(jī)體抗氧化酶，可有效清除O2-，避免細(xì)胞損傷，其含量高低可反映機(jī)體氧化應(yīng)激的損傷強(qiáng)度［14］.本研究中LS 組T-SOD 含量的降低幅度和MDA 含量的升高幅度均較GS 組更大，表明LS 組大鼠氧化應(yīng)激損傷更嚴(yán)重.

TGF-β1廣泛參與組織修復(fù)和炎癥等多種疾病過程，具有促纖維化作用，腎功能衰竭、腎炎和腎纖維化等疾病的發(fā)生均伴隨TGF-β1水平的升高［15］.TGF-β1還可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥因子的產(chǎn)生，增加炎癥反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn).因此通過抑制TGF-β1的陽性表達(dá)可以減輕腎組織的損傷程度［16］.本研究中，LS 組和GS 組TGF-β1陽性表達(dá)均上升，LS 組上升最明顯，表明LS 組大鼠腎損傷較嚴(yán)重.

Nrf2/HO-1 通路可調(diào)節(jié)機(jī)體因內(nèi)外環(huán)境變化引起的氧化應(yīng)激反應(yīng).Nrf2 能夠抑制TGF-β1的表達(dá)、調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，還能激活下游HO-1 的表達(dá).HO-1 存在于組織細(xì)胞中，可以清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基，防止機(jī)體出現(xiàn)氧化損傷［17］.但在毒性作用下，Nrf2 通路的激活受到抑制，導(dǎo)致HO-1 的表達(dá)也會(huì)相應(yīng)減少，無法發(fā)揮保護(hù)效果［18］.本 研 究中，LS 組Nrf2 和HO-1 水平較GS 組下降更為明顯，表明LS 組的Nrf2/HO-1 通路被抑制的程度更大，所遭受的毒性損傷也更為嚴(yán)重.

本研究結(jié)果初步闡明了雷公藤水提物對(duì)大鼠所造成的腎組織損傷比及己根水提取物更為嚴(yán)重的事實(shí)，并證實(shí)了其腎損傷與Nrf2/HO-1 信號(hào)通路以及生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激可能有關(guān).但本研究并不能確定是否存在其他通路導(dǎo)致了大鼠的腎組織損傷，相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步探索.

綜上所述，LS 組腎毒性大于GS 組，該機(jī)制可能為雷公藤水提取物通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷和抑制Nrf2/HO-1 信號(hào)通路導(dǎo)致更為嚴(yán)重的大鼠腎毒性.