一株豬源奇異變形桿菌的分離鑒定

張秋林，陳薈旭，潘姣姣，孫世浩，張偉信，李蓮瑞*

（1．塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2．新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

近年來關于奇異變形桿菌造成豬[1]、牛[2]、雞[3]、鴨[4]、孔雀[5]等動物發病的報道越來越多，隨著規模化養殖業的不斷發展，奇異變形桿菌給養殖業帶來的危害愈加嚴重。

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，PM）為革蘭氏陰性桿菌，屬腸桿菌科，變形桿菌屬，無莢膜且無芽孢。奇異變形桿菌是一種人獸共患的條件致病菌，該菌具有較強的遷徙能力[6]。廣泛分布于自然環境、人體和動物的體表、黏膜、消化道、糞便中。當機體免疫力下降時，可引起動物和人腹瀉、化膿性炎癥和敗血癥[1]。已有研究報道，奇異變形桿菌能一起豬發病，且有一定的致死性。奇異變形桿菌感染后臨床癥狀為高熱、氣喘、嘔吐、腹瀉，引起豬的敗血癥[7]。本研究通過對阿克蘇某生豬養殖場腹瀉仔豬肛拭子病原分離，并通過對該分離菌株進行16S rDNA基因序列比對，確定分離株為奇異變形桿菌，有利于豐富阿克蘇地區該條件致病菌的基礎資料，并對該細菌的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品來自烏什縣某生豬養殖場無菌采集的肛拭子。

試驗試劑：細菌DNA提取試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；核酸染料、DL2000Maker、RNasenfree Water、2×TaqPCRMasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購自天根生化科技（北京）有限公司；氯化鈉、瓊脂粉、酵母粉、蛋白胨均購自sigma公司。

試驗儀器：高壓鍋（HVE-50）購自上海天呈科技有限公司；小型臺式高速離心機（Eppendorf 5453）購自北京創世云博科技發展有限公司；小型高速冷凍離心機（Eppendorf 5426）購自北京創世云博科技發展有限公司；潔凈工作臺（SW-CJ-2ED）購自上海五久自動化設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的培養分離

無菌采集肛拭子，用接種環劃線接種于LB固體培養基上，放置37 ℃恒溫培養箱，培養24 h，觀察菌落形態。

1.2.2 染色鏡檢

用接種環挑取單菌落于載玻片上涂勻，用酒精燈固定15 s，革蘭氏染色，經結晶紫1 min、碘液1 min、95%酒精30 s、沙黃15 s，自然晾干后，100倍油鏡鏡檢。

1.2.3 細菌生化鑒定

將分離菌株分別接種于生化鑒定管，37 ℃培養24 h，觀察結果。

1.2.4 細菌的DNA的提取及16S rDNA的擴增

用全式金細菌DNA提取試劑盒（M10280）按其說明書進行DNA提取后，進行PCR擴增，細菌通用引物 序 列：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和11492R：5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR反應體系 ：25 μL、DNA 模板1 μL、2×TaqPCRMasterMix12.5 μL、27F和1492R各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL，振蕩混勻離心。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物取20 μL，經1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀中，進行觀察。

1.2.5 純化與測序

將出現與預期1 500 bp左右的目的條帶切膠回收，按照天根生化科技有限公司瓊脂糖凝膠回試劑盒（DP130419）說明書進行操作。將純化產物與pMD19-T載體連接后，送至上海生工生物科技有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離及形態特征（見圖1、圖2）

由圖1可知，在LB固體培養基上形成灰白色、邊緣整齊的光滑菌落。

由圖2可知，革蘭氏染色呈陰性，無莢膜、無芽孢、鏡下呈短桿狀、長桿狀及球狀等多形性桿菌。

2.2 細菌生化鑒定結果

生化鑒定結果為分離株能利用葡萄糖分解尿素，硫化氫試驗陽性；乳糖、麥芽糖、蔗糖、山梨醇、枸櫞酸鹽、吲哚、VP試驗陰性，初步判定為奇異變形桿菌。

2.3 16S rDNA擴增結果（見圖3）

由圖3可知，細菌PCR產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，獲得預期1 500 bp左右的目的條帶。

2.4 序列分析及測序結果

本次分離獲得的菌株序列長度大小為1 450 bp，將本次測序結果與國內外15株菌株比對，W1的起始位置為56～1 505，與國內外15株菌比較在1 489和1 490位點多了AC。W1與處于同一分支南京株JF775415相比除起始位置不同外，在其他位點序列均相同。

將純膠回收產物與pMD-19T載體自連后，送上海生工生物有限公司測序，測序結果見圖4。

2.5 16S rDNA序列同源性比較及遺傳進化樹構建（見圖5、圖6）

分離株W1與國內外菌株的同源性為96.4%～99.4%，W1與 GenBank登錄 號 JF775415、AB272366、KF051774、KJ881162的同源性最高，為99%～99.4%，與GenBank登錄號 AB932536、EU643833、HQ407305、KC456557、EF091150、KC211292、MH532480、HQ407319、KF471507的 同 源 性為98%～98.5%，與巴基斯坦株KT216564同源性較低為96.4%；遺傳進化樹顯示W1與JF775415親緣關系較近處于同一分支并和KJ881162構成同一亞群。

3 討論

奇異變形桿菌是條件致病菌。近年來，關于奇異變形桿菌引起動物和人發病的疫情報道越來越多，由奇異變形桿菌造成動物發病率和死亡率逐年增加[8-9]。奇異變形桿菌給養殖業造成的經濟損失及公共衛生威脅也越來越嚴重，應予以重視。

16S rDNA是國際上通用的對未知細菌的鑒定技術。科研人員可以用該方法快速確認細菌的種屬，通常認為16S rDNA序列同源性在99%～100%，為同一個種；97%～99%的序列同源性，為同一個屬[10-12]。本次分離株W1與JF775415、AB272366、KF051774、KJ881162為同一個種，與AB932536、EU643833、HQ407305、KC456557、EF091150、KC211292、MH532480、HQ407319、KF471507為同一個屬，與巴基斯坦株KT216564不是同一個屬。

本次試驗成功分離出一株細菌，將測序結果提交至NCBI經BLAST，同時用DNA star做同源性比對和構建遺傳進化樹分析，確定該分離株W1為奇異變形桿菌。此次從阿克蘇某生養殖場腹瀉仔豬肛拭子樣品中分離得到菌株W1，分析認為是仔豬免疫力較弱易受致病菌的侵襲[13]。本次試驗確定阿克蘇某規模化生豬養殖場感染奇異變形桿菌，該豬場應加強該病原菌的防控，加強飼養管理，做好病原菌的監測，減少公共衛生安全事件的發生。

4 結論

本試驗從腹瀉仔豬肛拭子中分離到一株細菌，采用生化鑒定和測序，經16S rDNA序列比對和構建遺傳進化樹分析，W1與南京株JF775415的同源性為99%，所以確定本次分離菌株W1為奇異變形桿菌。