木丹顆粒通過調控PI3K/AKT通路改善糖尿病大鼠神經病理性疼痛的研究

齊月，劉彥彤，張航，趙增杰

痛性糖尿病周圍神經病變(painful diabetic periphe-ral neuropathy,PDPN)屬于糖尿病引起周圍神經功能障礙、神經電生理等指標異常以及相關臨床癥狀的并發癥，1型糖尿病患病率大約占5%，2型糖尿病患病率大約占20%[1]。臨床上以自發性疼痛、接觸性疼痛、痛覺過敏等癥狀為主，嚴重影響患者睡眠、情緒等生活質量。然而其發病機制尚不明確，認為與炎性反應、氧化應激、多元醇通路激活、代謝紊亂、糖基化終產物堆積等有關[2]。目前對于PDPN治療比較棘手，主要采取控制血糖、改善微循環、營養神經、抗氧化應激、改善代謝、止痛等手段來緩解癥狀，而尚無有效方法來逆轉PDPN的進展,因此其治療成為一大難題[3]。中藥復方木丹顆粒具有益氣活血、通絡止痛功效，是臨床上第一個治療糖尿病周圍神經病變療效明確的創新性中成藥，充分發揮中醫藥多靶向、多途徑性作用，目前已經寫入中醫治療PDPN臨床路徑之中[4]。現觀察木丹顆粒是否通過PI3K/AKT信號通路發揮對PDPN調控作用的，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：健康SPF級Wistar雄性大鼠90只，8周齡，平均體質量(180.0±23.5)g，購自遼寧長生生物技術有限公司[合格證號：SCXK(遼)2013]，飼養于遼寧中醫藥大學動物實驗中心，室溫(21±3)℃，相對濕度(55～65)%，噪音<60 dB，分籠飼養，每籠5只，每日光照12 h，通風良好，普通飼料喂養，自由進食水。(2)藥物與試劑：木丹顆粒(營口奧達制藥有限公司生產)；甲鈷胺片(北京星昊醫藥股份有限公司生產)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司生產，采購于沈陽市皇姑區普祥生物試劑經銷處)；PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司生產)；PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT一抗和二抗(湖北雪瑾生物技術有限公司生產)。(3)儀器設備：血糖儀(美國強生)，Vonfrey儀(上海玉研科學儀器有限公司)，酶標儀(Thermo-Fisher)，離心機(Thermo-Fisher)，電泳儀(biorad)，凝膠成像儀(biorad)，定量PCR儀(biorad)。

1.2 實驗方法 2018年11月—2019年4月在遼寧中醫藥大學實驗中心進行實驗。

1.2.1 造模與分組：將雄性Wistar大鼠90只適應喂養7 d后，隨機選取12只為正常組(CON組)，其余78只大鼠進行造模，正常組將等體積的0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液單次腹腔注射，造模大鼠按STZ 53 mg/kg一次性腹腔注射，繼續喂養72 h后測定大鼠尾靜脈血糖，血糖>16.7 mmol/L者列為觀察對象，14日后測機械性痛閾及神經傳導速度，明顯下降者為PDPN造模成功(在實驗過程中糖尿病造模失敗5只，PDPN造模失敗13只)。再根據隨機數字表法將成模大鼠60只隨機分為5組：模型組(MOD)、木丹顆粒低劑量組(MD-L)、木丹顆粒中劑量組(MD-M)、木丹顆粒高劑量組(MD-H)、甲鈷胺組(JGA)，每組12只。

1.2.2 實驗給藥：大鼠灌胃給藥劑量參照《動物實驗方法學》[5]，按照成人每日中藥用量與體質量折算系數的 6.25 倍計算藥量。木丹顆粒低劑量組劑量為1.615 g·kg-1·d-1，中劑量組劑量為3.231 g·kg-1·d-1，高劑量組劑量為6.462 g·kg-1·d-1，甲鈷胺組劑量為0.231 mg·kg-1·d-1，上述藥物均用蒸餾水配制，濃度保證大鼠灌胃體積為1 ml/100g，每次配制200 ml,放置在4℃保存；模型組和正常組按等容積蒸餾水灌胃。以上6組均從成模后開始每日固定時間灌胃給藥1次，連續8周實驗結束。實驗期間大鼠予普通飼料喂養，自由進食和飲水。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 體質量及血糖測定：于給藥前及給藥后2 w、4 w、8 w稱大鼠體質量，并采用強生血糖儀測定尾靜脈血糖，采血針淺刺大鼠尾部下1/3處尾部靜脈， 使血液充分滴入血糖試紙中，按照血糖儀顯示數值記錄血糖。

1.3.2 機械痛閾測定[6]：于給藥前及給藥后2 w、4 w、8 w采用標準化Vonfrey儀測定各組大鼠后足的機械縮足反應閾值(MWT)：將大鼠置于金屬網架上的透明有機玻璃盒內，讓大鼠適應環境至少15 min，待大鼠的梳理和探究等活動基本消失，安靜并出現洗臉、梳理毛發等活動后，用電子Vonfrey儀的探頭纖維垂直剌激大鼠后肢足底中部，以大鼠在刺激后出現快速的縮足反應為陽性反應，記錄此時的受力數值(g)；每只大鼠每側足底測量3次，每一次測量后，待大鼠適應環境3～5 min后再次測量。因身體活動所引起的縮足反應不記作陽性反應。

1.3.3 神經傳導速度測定[7]：于給藥前及給藥后2 w、4 w、8 w檢測大鼠坐骨神經傳導速度。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定成仰臥位，分離大鼠坐骨神經，將刺激電極一端放在坐骨神經干，而另一端放在神經干腓支起始處，記錄兩電極之間的距離D(mm)和動作電位，刺激強度由小到強，分別計算2個點刺激產生動作電位的潛伏期T1和T2(ms)，記錄測定的肌電圖，按照傳導速度計算公式為：V(m/s)=D(mm)/(T1-T2)(ms)，記錄結果。

1.3.4 大鼠PI3K和AKT基因、蛋白表達水平測定：于用藥后8 w末各組隨機取8只大鼠，用20%烏拉坦( 0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定俯臥位，迅速取大鼠脊髓組織1 cm×0.15 cm 和L2～5背根神經節，置入液氮中冷凍，保存于-80℃冰箱中。

1.3.4.1 PI3K和AKT基因表達 (1)總RNA的提取:按照Trizol 法提取L4～5背根神經節和脊髓總RNA。(2)cDNA 模板的制備:分別取RNA 1μg按照M-MLV 逆轉錄酶說明書反轉錄成cDNA，稀釋cDNA原液以作為cDNA工作液。(3)定量PCR: 以反轉錄所得cDNA為模板進行PCR擴增反應，用 Primer Premier 5.0軟件設計引物，β-actin內參照253 bp，G1: 5＇-GCCTCGCTGTCCACC TTCCA-3＇，G2:5＇-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3＇；PI3K 擴增產物377 bp，上游引物: 5＇-CATCACTTCCTCCTGCTCTAT-3＇，下游引物: 5＇-CAGTTGTTGGCAATCTTCTTC-3＇；Akt 擴增產物121 bp，上游引物: 5＇-GGACAACCGCCATCCAGA CT-3＇，下游引物: 5＇-GCCAGGGACACCTCCATCTC-3＇，采用 PE9600定量PCR儀進行mRNA水平檢測。PCR反應體系為20 μl，PCR擴增反應條件為: 95℃預變性5 min; 94℃變性30 s，55℃ 30 s，45個循環, 72℃延伸7 min。

1.3.4.2 PI3K和AKT蛋白水平 (1)提取組織蛋白：取凍存的L 2～3背根神經節和脊髓組織，充分研碎，加入蛋白裂解液，再轉移到EP管，放置冰上；每5 min振蕩1次，振蕩6次，使組織充分裂解，收集懸液，12 000 r/min 4℃ 離心15 min，收集上清，轉移分裝到另一個EP管，保存在-80℃待用。(2)BCA法測定提取蛋白濃度：用蒸餾水稀釋蛋白樣品，取適量BCA試劑盒A液和B液，按50∶1混勻成工作液，將反應后的蛋白溶液，加入到孔板中，振蕩30 s，測定吸光度，計算蛋白濃度，同時將樣品蛋白保存在-80℃待用。(3)Western blot：制備聚丙烯酰胺凝膠，取樣品蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉移到PVDF膜上，室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)孵育，4℃過夜，TTBS洗膜，加入二抗(1∶2 000)孵育1 h，蛋白質免疫檢測，化學發光增強劑顯色，用凝膠成像儀掃描，以目的蛋白與β-actin的灰度比值作為內參，分析并讀取蛋白條帶灰度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠給藥前后體質量比較 與CON組比較,MOD組在給藥2 w、4 w、8 w后體質量均明顯減輕，差異有統計學意義(P<0.01)；與MOD組比較,MD-L、MD-M、MD-H組大鼠在給藥2 w、4 w、8 w后體質量均有不同程度增加,其中各組在給藥4 w、8 w后差異有統計學意義(P<0.01)；與MD-L組比較,同期MD-M、MD-H組大鼠在給藥2 w、4 w、8 w后體質量有不同程度增加,其中MD-H組給藥4 w、8 w后體質量差異有統計學意義(P<0.05)；與MD-M組比較， MD-H組在給藥8 w后體質量增加(P<0.05)；與MD-H組比較，JGA組在給藥4 w、8 w后體質量下降(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠給藥前后體質量比較

2.2 各組大鼠給藥前后血糖比較 與CON組比較,MOD組在給藥2 w、4 w、8 w后血糖均明顯升高(P<0.01)；與MOD組比較,同期MD-L、MD-M、MD-H組在給藥2 w、4 w、8 w后血糖不同程度降低,其中MD-H組在給藥4 w、8 w后具有顯著性差異(P<0.01)；與MD-L組比較,同期MD-M、MD-H組在給藥4 w、8 w后血糖有不同程度降低,其中MD-H組給藥4 w、8 w后血糖有差異(P<0.05或P<0.01)，與MD-M組大鼠比較,MD-H組在給藥4 w、8 w后有差異(P<0.05),與MD-H組大鼠比較,JGA組在給藥4 w、8 w后有差異(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠給藥前后血糖比較

2.3 各組大鼠給藥前后機械痛閾比較 與CON組比較,MOD組給藥2 w、4 w、8 w后機械痛閾敏感性明顯下降(P<0.01)；與MOD組比較,同期MD-L、MD-M、MD-H組及JGA組在給藥2 w、4 w、8 w后機械痛閾敏感性均有不同程度升高,在4 w和8 w差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；與MD-L組比較,同期MD-H量組在給藥8 w后升高(P<0.05)，其余無差異(P>0.05)；與MD-M組比較,MD-H組在給藥8 w差異具有統計學意義(P<0.05),與MD-H組比較,JGA組在給藥4 w、8 w后無差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠給藥前后機械痛閾比較

2.4 各組大鼠給藥前后坐骨神經傳導速度比較 與CON組比較,同期MOD給藥2 w、4 w、8 w后坐骨神經傳導速度均明顯減慢(P<0.01)；與MOD組比較,同期MD-L、MD-M、MD-H組及JGA組在給藥2 w、4 w、8 w后坐骨神經傳導速度均有不同程度加快,其中MD-L組在給藥8 w后，MD-M、MD-H組及JGA組在給藥4 w、8 w后有差異(P<0.05或P<0.01)；與MD-L組比較,同期MD-M、MD-H組及JGA組在給藥4 w、8 w后有差異(P<0.05或P<0.01)；與MD-M組比較，同期MD-H組及JGA組在給藥2 w、4 w、8 w后無差異(P>0.05)；與MD-H組比較，同期JGA組在給藥2w、4w、8w后無差異(P>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠給藥前后坐骨神經傳導速度比較

2.5 各組大鼠PI3K和AKT基因的表達水平 給藥8周后，與CON組比較，MOD組PI3K和AKT mRNA 表達均降低(P<0.01)；與MOD組比較，MD-L、MD-M、MD-H組及JGA組PI3K和AKT mRNA 表達均有升高(P<0.05或P<0.01 )；與MD-L組比較,MD-M、MD-H組及JGA組PI3K和AKT mRNA 表達均升高(P<0.05或P<0.01)；與MD-M組比較，MD高劑量組及JGA組PI3K和AKT mRNA 表達均升高(P<0.05)；與MD-H組比較，JGA組PI3K和AKT mRNA 表達無差異(P>0.05)，見表5。

表5 各組大鼠PI3K、AKI基因表達量比較

2.6 各組大鼠PI3K/AKT蛋白水平比較 與CON組比較，MOD組PI3K、AKT蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與MOD組比較，MD-M、MD-H組及JGA組均明顯增高(P<0.01 或P<0.05)，見圖1。

注：A.CON組；B.MOD組；C.JGA組;D.MD-L組；E.MD-M組；F.MD-H組

3 討 論

目前，糖尿病發病率逐年升高，中國民眾患病率約10.9%，到2035年預計將增加到5.92億，可以累及心、腦、腎、血管、神經等，已經成為危害人體健康的世界性代謝疾病之一[8]。同時，糖尿病神經系統并發癥的患病率也呈逐漸上升趨勢，其中痛性糖尿病周圍神經病變是臨床上最為常見的神經并發癥之一，約有25%糖尿病患者會存在PDPN，主要表現為肢體或軀干灼熱痛、刺痛，甚至難治性疼痛，嚴重影響糖尿病患者生活和工作質量。

現代醫學對PDPN發病機制尚未完全闡明，目前PI3K/AKT信號通路在其發病過程的作用引起人們越來越多的關注。PI3K/AKT 信號通路是細胞內外信息傳遞和應答的橋梁，激活后可以參與多個疾病的生理和病理過程[9]。PI3K/AKT 信號通路是胰島素重要的下游信號傳導途徑，胰島素發揮生物效應離不開 PI3K/AKT 信號通路的正常轉導，因此PI3K/AKT 信號通路具有調節血糖的功能[10-11]。研究證實，PI3K/AKT 信號通路在糖尿病狀態下會受到抑制。本研究結果證實，MOD組大鼠處于持續高血糖狀態，PI3K和AKT表達量明顯降低，而木丹顆粒各組PI3K和AKT表達量升高，血糖也有所降低，在一定程度上提示木丹顆粒可能通過激活PI3K/AKT信號通路來降低PDPN大鼠血糖。

PI3K/AKT信號通路是調控細胞周期的經典通路之一，參與神經元細胞生長、分化、增殖等一系列細胞功能，在細胞存活及凋亡中起著關鍵作用。有研究發現，PI3K/AKT通路在糖尿病和神經系統疾病中扮演著各種重要角色[12]，被認為是誘發和維持神經性疼痛的關鍵因素[13]，該通路在糖尿病性神經元中被抑制，如果此通路被激活，會減弱高血糖誘導的神經元凋亡[14]，緩解神經痛。本研究結果顯示，MOD組大鼠機械性痛閾和神經傳導速度延長，而木丹顆粒各組大鼠痛閾提高、神經傳導速度加快，由此說明PI3K/AKT信號通路激活在PDPN神經電生理的改變上起到了一定作用。

對于PDPN，西醫治療除了控制血糖、改善微循環、抗氧化、鎮痛、抗抑郁外，并無理想藥物[15]，往往是治標不治本，治療后極易復發。因此，單純依靠現代醫學治療方法存在局限性，應充分發揮中醫藥優勢，中西醫結合治療是必要的。PDPN屬于中醫“消渴病痹癥”范疇，辨證多認為由氣虛血瘀所致，而木丹顆粒是益氣活血、通絡止痛的代表性藥物。既往研究表明，木丹顆粒可以加快神經傳導速度，減少細胞凋亡，降低氧化應激和炎性反應，改善糖脂代謝，改變血液流變學障礙等[16-20]。

本實驗應用木丹顆粒干預PDPN大鼠模型，結果表明，與CON組比較，MOD組大鼠背根神經節PI3K和AKT mRNA和蛋白表達均降低。說明MOD組PDPN大鼠PI3K/AKT信號通路被激活引起組織損傷。木丹顆粒干預后，明顯升高神經組織PI3K和AKT mRNA含量，使PI3K和AKT蛋白表達升高，減輕神經組織的炎性損傷，而且效果呈劑量相關性，隨著木丹顆粒的劑量增加而更明顯，木丹顆粒中、高劑量組與JGA組效果相當。

總之，本研究通過木丹顆粒對痛性糖尿病周圍神經病變大鼠PI3K/AKT 信號通路的影響，推測木丹顆粒可能通過上調 PI3K/AKT 信號通路相關蛋白的表達，減輕胰島素抵抗，增加胰島素的敏感性，減少神經組織細胞凋亡，發揮緩解糖尿病神經病理性疼痛作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

齊月：設計研究方案，論文撰寫；劉彥彤、張航：實施研究過程，資料搜集整理；趙增杰：進行統計分析