miR-21和miR-146a在癲癇患者中的表達及臨床意義

黃忠，曾義，王曦，趙戈

癲癇是神經內科較為常見的中樞神經系統疾病，其發病率近年來呈逐步上升趨勢，以腦部神經元放電異常所致的短暫且反復的神經中樞功能失常為主要臨床特征[1]。癲癇發作對患者的身體和精神均會造成嚴重影響，癲癇長期和反復發作容易對中樞神經造成損傷，具有一定致殘率和病死率，給患者的日常生活造成嚴重負擔[2]。引起癲癇的病因較為復雜，如遺傳因素、腦部疾病和系統性疾病均可能引起癲癇發生，目前缺乏有效的臨床治療手段[3]。研究顯示，在癲癇發作過程中部分微小RNA(miRNA，miR)表達異常，可以作為癲癇診斷和預后預測的生物學標志物[4]。miR是一類長度為20～24個堿基的短鏈RNA，不編碼蛋白質，在體內廣泛分布，參與細胞增殖、分裂和分化等一系列生物學過程[5]。miR-21與中樞神經系統疾病的發病密切相關，參與腦部炎性反應，其表達量升高會促進缺血性腦卒中和神經損傷的發生[6-7]。miR-146a同樣參與中樞神經系統的發病過程，與星形膠質細胞發育異常相關，參與唐氏綜合征和阿爾茨海默癥的發病過程[8-9]。 現分析癲癇患者血清miR-21和miR-146a表達水平及其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年4月—2019年5月成都中醫藥大學附屬第五人民醫院/成都市第五人民醫院神經內科診治的癲癇患者99例作為癲癇組，選擇同期醫院健康體檢者99例作為健康對照組。健康對照組男51例，女48例，年齡24～68(48.25±16.73)歲；體質量指數(BMI)18.8～22.9(21.42±1.32) kg/m2。癲癇組男55例，女44例，年齡25～70(50.14±18.26)歲；病程1～12(6.74±1.96)年；BMI 18.5～22.1(20.77±1.08)kg/m2；癲癇類型：單純部分性癲癇發作45例，復雜部分性癲癇發作21例，繼發性癲癇全面發作33例；癲癇嚴重程度量表(NHS3)[10]評分11～21(16.05±4.46)分；吸煙史48例，酗酒史39例；高血壓史49例，糖尿病史22例，高脂血癥史5例，冠心病史1例。2組性別、年齡及BMI比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合2017年國際抗癲癇聯盟制定的癲癇發作診斷標準[11]：有>2次非誘發性或非反射性癲癇發作，且間隔>24 h；患者已發生1次非誘發性或非反射性癲癇發作，且患者在未來10年內癲癇復發風險與2次非誘發性或非反射性癲癇發作后復發風險相當，符合以上任意1條即可確診；②經腦電圖及頭部CT和MR檢查診斷；③年齡>18歲；④入院前6個月內未接受過相應抗炎治療。(2)排除標準：①合并腫瘤患者；②存在腦部手術史者；③存在全身性感染性疾病；④存在自身免疫性疾病；⑤存在藥物依賴性疾病；⑥存在精神障礙性疾病。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 血清miR-21和miR-146a表達量檢測：采用熒光定量PCR儀(美國ABI科技有限公司生產，型號：ABI5800)檢測。患者入院翌日晨/健康對照組體檢當日采集空腹肘靜脈血5 ml，高速離心機(湖南湘儀科技有限公司生產，型號：H1650)5 000 r/min離心30 min后吸取上清液待檢測，離心半徑12.5 cm。采用mirVana miRNA分離試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司生產)提取血清miRNA，使用miRNA cDNA合成試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司)對提取獲得的miRNA進行逆轉錄，逆轉錄體系：miRNA 5 μl，反轉錄緩沖液5 μl，10×miRNA反轉錄引物2 μl，水8 μl。反轉錄條件：37 ℃、60 min，95 ℃、5 min。使用mirVana qRT-PCR miRNA檢測試劑盒對cDNA進行定量檢測，反應體系25 μl，包括水16.5 μl，5×PCR buffer 5 μl，50×ROX溶液0.5 μl，DNA聚合酶1 μl，PCR上游引物1 μl，PCR下游引物1 μl。反應條件：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，進行35個循環。miR-21上游引物序列：5’-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。 miR-146a上游引物序列：5’-TGCGCTGAGAACTGAATTACCAT-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，以U6基因作為內參基因，U6上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游引物序列：5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’。根據2-△△Ct法計算miR-21和miR-146a的相對表達量。

1.3.2 血清TNF-α和IL-6水平檢測：使用TNF-α檢測試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司生產)及IL-6檢測試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司生產)，以酶聯免疫吸附法檢測血清TNF-α和IL-6水平，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 各組血清miR-21、miR-146a表達和炎性因子水平比較 癲癇組血清miR-21、miR-146a表達水平和血清TNF-α、IL-6水平明顯高于健康對照組(P均<0.01)，見表1。

表1 2組受試者血清miR-21、miR-146a表達水平和炎性因子水平比較

2.2 血清miR-21、miR-146a表達與血清TNF-α、IL-6水平及NHS3評分相關性分析 血清miR-21與NHS3評分表達呈高度正相關(P<0.01)，而與IL-6和TNF-α呈中度正相關(P<0.01)。血清miR-146a與血清TNF-α和NHS3評分均呈中度正相關(均P<0.01)，而與IL-6呈弱正相關(P<0.01)，見表2。

表2 血清miR-21和miR-146a表達與血清TNF-α和IL-6水平及NHS3評分相關性分析

2.3 血清miR-21和miR-146a表達水平診斷癲癇價值分析 采用ROC曲線下面積(AUC)評估血清miR-21、miR-146a及二者聯合診斷癲癇的價值，結果顯示，miR-21、miR-146a及二者聯合診斷癲癇的AUC分別為0.760、0.793、0.884，見表3、圖1。

3 討 論

神經元放電活動異常與基因遺傳、免疫系統紊亂和病毒性感染等因素相關，神經元的放電異常是導致癲癇發作的主要因素[12]。對于年齡在35歲以上的中樞神經系統病變患者癲癇發病率明顯升高，為普通人群的3～5倍[13]。臨床研究顯示，目前的癲癇治療臨床有效率低于45%，并且停止治療后有較高的復發率，嚴重影響患者的日常生活。傳統的臨床診斷方式往往更依賴醫生的個人經驗，且癲癇的癥狀與暈厥有著高度相似性，不易區分，血清miR的檢測具有可重復性強、周期較短、不過于依賴個人經驗的優點，因此對癲癇發作過程中涉及到的相關基因表達變化進行系統研究有助于癲癇的治療和診斷，為癲癇的靶向治療及診斷提供新的生物標志物靶點及診療策略[14]。

圖1 血清miR-21和miR-146a診斷癲癇的ROC曲線

在腫瘤發病及心腦血管疾病發生過程中miRNA均起到重要的調節作用，miRNA通過與基因的信使RNA(mRNA)結合促進mRNA降解，使得基因轉錄水平下降，進而影響基因的翻譯，引起基因編碼蛋白質水平的下降，影響相應信號通路的活化，導致疾病的發生[15]。癲癇發病過程中能夠觀察到患者星形膠質細胞體積增大，胞漿肥大，細胞核縮小并且偏位，星形膠質細胞存在發育異常[16]。在生理狀態下，星形膠質細胞能夠分泌神經因子至胞外，作用于神經元并對神經元具有一定的保護作用。而在病理條件下，星形膠質細胞之間產生較強的縫隙連接，并形成相應的星形膠質細胞網絡。縫隙連接的增強會促進神經元的同步化放電，而同步化放電是造成驚厥的生理基礎，因此縫隙連接的增強會導致癲癇發作[17]。本研究發現，癲癇患者血清miR-21水平明顯升高，其原因可能是由于miR-21在星形膠質細胞分化成熟過程中起到一定抑制作用，已有研究報道顯示，miR-21會抑制星形膠質細胞的分化，導致星形膠質細胞的功能異常，并且miR-21能夠活化信號轉導與轉錄激活因子3(signal transduction and transcriptional activator 3, STAT3)信號通路以增強磷脂酰肌醇聚糖6蛋白的表達，進而促進急性缺血性脊髓損傷的發生。磷脂酰肌醇聚糖6蛋白參與縫隙連接的形成，其表達水平的升高會促進神經元之間縫隙連接的產生，從而促進神經元同步化放電[18]。miR-146a則是由星形膠質細胞產生的一類miRNA，Sison等[19]發現在病理條件下，星形膠質細胞產生的過量miR-146a會下調神經元的數量，進而導致脊髓型肌萎縮的發生。由于癲癇患者中普遍能夠觀察到發育異常的星形膠質細胞分泌大量miR-146a至胞外，從而導致血清miR-146a水平升高。

表3 血清miR-21和miR-146a表達水平診斷癲癇的ROC 分析

本研究探討血清miR-21和miR-146a與癲癇發病之間的關系，結果顯示，癲癇患者體內存在一定程度的炎性反應，并且伴隨炎性反應的發生血清miR-21和miR-146a也隨之升高。進一步研究發現癲癇患者血清miR-21和miR-146a的升高與炎性反應發生之間存在聯系，并且與癲癇病情嚴重程度存在相關性。癲癇發作與炎性反應聯系密切，腦部炎性反應的產生會導致腦部生理環境及局部微環境發生紊亂，內環境中神經遞質、神經因子、細胞因子水平紊亂會造成神經元放電異常，導致癲癇發生。miR-21與炎性反應的聯系在既往研究中并不少見，Xue等[20]研究發現，在膿毒性休克患者血清中miR-21水平明顯升高，并且miR-21參與炎性小體的形成和激活。Venugopal等[21]的研究表明，miR-21是NF-κB炎性反應信號通路的下游靶基因，核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信號通路活化在引起TNF-α和IL-6等炎性因子水平升高的同時會上調miR-21表達。癲癇發作過程中炎性反應水平升高并且炎性相關信號通路活化，使TNF-α和IL-6等炎性因子水平及miR-21升高，miR-21表達水平升高促進炎性小體的形成，從而對炎性反應起到正反饋調節的作用，使炎性反應的強度和范圍逐步擴大，加劇癲癇患者病情。miR-146a同樣參與炎性反應過程，如Sun等[22]研究表明，基質細胞衍生因子受體(cxc chemokin receptor 4,CXCR4)基因是miR-146a的靶基因，miR-146a作用于CXCR4 mRNA的3’端并促進其降解，導致CXCR4蛋白表達水平升高。而CXCR4是十分重要的炎性反應抑制分子，miR-146a下調CXCR4蛋白表達會導致炎性反應加劇。同時，Chen等[23]研究發現，病毒感染會促進miR-146a的產生及NF-κB信號通路活化，NF-κB信號通路活化促進IL-8、CC趨化因子配體5(CC chemokine ligand 5,CCL5)和干擾素β(interferon β,IFN-β)等炎性因子的釋放，導致炎性因子水平升高。miR-146a與NF-κB信號通路之間存在正反饋調節，miR-146a水平升高促進NF-κB信號通路的活化，使得炎性反應進一步加劇。因此在癲癇患者體內，一方面炎性反應的發生會上調miR-146a水平，另一方面，miR-146a表達量上調會促進NF-κB信號通路的活化，進一步加劇炎性反應，導致癲癇患者病情加重[24]。

ROC曲線結果還顯示，血清miR-21和miR-146a聯合檢測的敏感度和特異度明顯高于各指標單獨檢測，分析其原因可能是由于血清miR-21和miR-146a單獨檢測具有一定的漏檢率，二者聯合檢測能夠有效降低漏檢率，從而提高檢測的敏感度和特異度，并且研究結果提示血清miR-21和miR-146a聯合檢測可以作為癲癇發作的輔助標志物。

綜上所述，癲癇患者血清miR-21和miR-146a水平及炎性因子TNF-α和IL-6水平升高，血清miR-21、miR-146a與炎性因子TNF-α、IL-6水平及NHS3評分均呈正相關，在癲癇患者的診斷中具有一定臨床價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

黃忠：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；曾義：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;王曦：進行統計學分析；趙戈：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核