miR-125b在病毒性腦炎患兒中的表達水平及其與Th17/Treg平衡及預后的關系

朱莉，姜遠安，肖冠華，何志毅，李君軍

病毒性腦炎是中樞神經系統常見的一種疾病，伴有腦實質炎性反應，病因復雜多樣，主要是腦實質或腦膜被各種病毒入侵后所引起的一種感染性疾病，通常與機體的免疫功能低下有關[1-3]。 據統計，兒童病毒性腦炎的發病率從3.5/10萬～7.4/10萬上升到了16/10萬[4]。不同病情的病毒性腦炎患兒預后也不同，嚴重者可能出現不同程度的發育遲緩、肢體癱瘓甚至死亡[5]。因此，早期識別不良預后的患兒，可以幫助醫生采取更有效的治療措施來改善患兒預后情況，但現在臨床上仍然缺乏預測不良預后的敏感生物學指標。近年研究顯示，微小RNA(microRNA，miR)在調節細胞發育和功能中起關鍵作用，多種miR可用作疾病預后的生物標志物[6-7]。據報道，miR-125b與炎性疾病的發展及T細胞分化有關，與機體的免疫功能密切相關，在神經系統腫瘤中有一定的診斷價值[8]。miR-125b是否通過T細胞分化影響病毒性腦炎的病理過程尚不清楚，與病毒性腦炎患兒預后的關系也未見報道，因此本研究通過測定病毒性腦炎兒童血漿miR-125b水平，分析miR-125b與機體輔助性T細胞17(Th17)/調節性T細胞(Treg)平衡的關系，并探討影響病毒性腦炎患兒不良預后的危險因素，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2019年11月湖南省郴州市第一人民醫院兒童危重癥科收治病毒性腦炎患兒110例為腦炎組，其中男72例，女38例，年齡1～12 (4.25±2.74)歲；住院時間7～38(23.42±13.83)d；臨床癥狀：發熱92例，頭痛46例，有意識改變56例，存在驚厥持續狀態34例，伴有應激性高血糖35例；致病病毒：腸道病毒78例，巨細胞病毒16例，EB病毒11例，單純皰疹病毒1型3例，單純皰疹病毒2型2例。選取同期體檢健康兒童100例為健康對照組，男68例，女32例，年齡1～12(4.84±2.82)歲。2組對象的性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核批準，受試者家屬或其監護人知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①病毒性腦炎患兒診斷符合國際腦炎聯合會兒童病毒性腦炎的診斷標準[9]；②相關實驗室檢查和影像學檢查資料完整；③年齡<14歲。(2)排除標準：①合并其他細菌感染；②合并免疫系統疾病；③存在肝腎功能異常；④近期使用過糖皮質激素和免疫抑制劑等藥物。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血漿標本采集：患兒于確診次日清晨/健康兒童于體檢當日空腹采集肘靜脈血6 ml， 并儲存在含有肝素鈉的抗凝劑管中， 2 ml用于流式細胞術，4 ml于4℃離心，將血漿移至新EP管中，在-80℃超低溫冰箱儲存用于檢測血漿miR-125b水平和炎性因子水平。

1.3.2 實時定量PCR檢測血漿miR-125b水平：使用血漿RNA提取試劑盒(哈爾濱新海基因檢測有限公司)提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒(廣州易錦生物技術有限公司)將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時定量PCR。miR-125b正向引物序列：5'-GATCTGCAGCTCTCCCAGGGGCTGGCTTCAG-3'，反向引物序列：5'-GATCATATGGAGGCAGAAAGGATGGAGAAGT-3'；U6作為內參，其正向引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。實時定量PCR反應體系總體積為20 μl，反應體系包括：SYBR Green染料、正向引物、反向引物、dNTP、Taq酶、ddH2O；反應條件：94 ℃ 1 min預變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 20 s延伸，連續40個循環。每個樣本設置3個復孔，miR-125b的表達水平用2-△△Ct表示。

1.3.3 Th17和Treg細胞檢測：上述血液2 ml使用流式細胞術檢測Th17和Treg細胞，使用PBS緩沖液將血細胞稀釋至8 ml，加入到人淋巴細胞分離液的界面上， 于4℃時離心獲得血清，使用PBS緩沖液洗滌2次，使用流式細胞儀(艾森生物NovoCyte)檢測Th17和Treg，計算Th17/Treg比值。

1.3.4 血漿炎性因子檢測：使用酶聯免疫吸附試驗檢測白介素17(IL-17)、IL-6、IL-10和轉化生長因子-β(TGF-β)水平，試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司，操作嚴格按照說明書進行。

1.3.5 預后判斷： 隨訪6個月，收集相關信息，使用兒童格拉斯哥預后量表(GOS)[10]評估病毒性腦炎患兒預后。GOS 1級：死亡；GOS 2級：植物狀態；GOS 3級：日常生活學習無法自理，需要照料，嚴重殘疾；GOS 4級：日常生活學習可獨立，輕度殘疾；GOS 5級：恢復良好，日常生活學習可自理，正常活動。將GOS評級1～3級劃分為預后差亞組， 4～5級為預后良好亞組。

2 結 果

2.1 2組血漿miR-125b、Th17、Treg和Th17/Treg比值比較 腦炎組患兒血漿miR-125b、Th17水平和Th17/Treg比值顯著高于健康對照組，Treg水平顯著低于健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 2組受試者血漿miR-125b、Th17、

2.2 2組炎性細胞因子比較 腦炎組患兒血漿IL-17和IL-6水平均高于健康對照組，IL-10和TGF-β水平均低于健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 2組受試者血漿IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比較

2.3 不同預后患兒臨床資料比較 110例病毒性腦炎患兒中，預后良好72例(65.45%)，預后不良38例(34.55%)。 預后良好亞組和預后不良亞組患兒的意識改變、驚厥持續狀態、是否有應激性高血糖、腦CT異常、腦MR異常、血漿miR-125b、Th17/Treg、IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。不同預后患兒的性別、年齡、發熱和頭痛比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同預后患兒臨床資料比較 [例

2.4 miR-125b、Th17/Treg、炎性因子與預后的相關性 腦炎組患兒血漿miR-125b水平與IL-17、IL-6、Th17/Treg及預后均呈正相關(r/P=0.810/0.000、0.689/0.004、0.778/0.000、0.793/0.000)，與IL-10和TGF-β水平均呈負相關(r/P=-0.797/0.000、-0.748/0.000)；腦炎組患兒血漿Th17/Treg與IL-17、IL-6及預后均呈正相關(r/P=0.873/0.000、0.701/0.004、0.878/0.000)，與IL-10和TGF-β水平均呈負相關(r/P=-0.644/0.018、-0.796/0.000)。

2.5 病毒性腦炎預后多因素Logistic回歸分析 將上述結果中有統計學意義的指標納入多因素Logistic回歸分析，其中因變量為病毒性腦炎患兒預后(1=不良，0=良好)，自變量為意識改變(1=有，0=無)，驚厥持續狀態(1=有，0=無)，腦CT異常(1=有，0=無)，腦MR異常(1=有，0=無)，應激性高血糖(1=有，0=無)，血漿miR-125b(實際值)，Th17/Treg比值(實際值)、IL-17(實際值)、IL-6(實際值)、IL-10(實際值)和TGF-β(實際值)。結果顯示，有意識改變、有驚厥持續狀態、腦CT異常、腦MR異常、有應激性高血糖、血漿miR-125b水平升高是病毒性腦炎患兒預后的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 病毒性腦炎患兒預后多因素分析

3 討 論

兒童病毒性腦炎是兒科的常見病，會引起腦組織水腫、壞死、腦功能損害等病理改變，臨床表現為發熱、嘔吐、頭痛、意識改變、抽搐、癲癇發作和局灶性神經功能缺失等癥狀，嚴重影響兒童的生活質量和生命健康。當兒童抵抗力降低時，病毒可以侵入中樞神經系統，引起腦實質炎性反應[11]。T細胞是人體重要的免疫細胞，主要分為Treg、Th和細胞毒性T細胞[12]。Th17是新發現的CD4+T細胞亞群，與Treg在功能上相互抑制，二者在體內的動態平衡狀態在維持機體免疫穩態中發揮重要作用，Th17/Treg失衡可導致感染性疾病、腫瘤和自身免疫性疾病的發生[13-14]。

本結果發現，病毒性腦炎患兒血漿Th17水平和Th17/Treg比值高于健康對照組，Treg水平低于健康對照組，說明病毒性腦炎患兒體內出現Th17細胞活化，Treg細胞抑制，從而出現Th17/Treg失衡，這一現象與既往研究中細胞感染病毒后，可以誘導Th17細胞活化，抑制Treg細胞活化的結論相吻合[15]。本結果顯示，腦炎組患兒血漿IL-17和IL-6水平顯著高于健康對照組，IL-10和TGF-β水平顯著低于健康對照組，說明病毒性腦炎患兒體內出現了明顯的炎性反應，這是因為Th17可以產生IL-17和IL-6等細胞因子，參與中性粒細胞的增殖、趨化和激活，導致細胞組織炎性損傷[16]。Treg主要分泌IL-10和TGF-β發揮免疫抑制作用，TGF-β通過反饋調節維持Treg數量和功能，同時還可以抑制效應T細胞的增殖和分化[16]。病毒性腦炎患兒體內Th17/Treg失衡，進而導致促炎性細胞因子(IL-17和IL-6)分泌增加，抗炎性細胞因子(IL-10和TGF-β)分泌減少，導致腦組織炎性損傷加重，這些機制可能參與了兒童病毒性腦炎的病理過程。

miR是一種非編碼單鏈RNA，可以與mRNA結合抑制mRNA的翻譯過程，從而調節蛋白質的表達[6-7]，既往研究顯示，miR-125b與炎性疾病的發展和機體的免疫功能密切相關[8]，本結果發現，腦炎組患兒血漿miR-125b水平顯著高于健康對照組，說明miR-125b可能參與了病毒性腦炎的發生發展過程。本研究腦炎組患兒血漿miR-125b水平與IL-17、IL-6、Th17/Treg、預后均呈正相關，與IL-10和TGF-β水平均呈負相關，表明miR-125b可能是通過影響Th17/Treg的平衡狀態，進而引起炎性因子釋放紊亂，介導炎性反應發生來參與病毒性腦炎的發生發展過程和預后。miR-125b引起Th17/Treg失衡的機制可能與視黃酸相關的孤兒受體γt和轉錄因子Foxp3有關，目前有研究發現，miR-125b可以影響視黃酸相關的孤兒受體γt和轉錄因子Foxp3的表達，而視黃酸相關的孤兒受體γt在Th17分泌IL-17過程中起調節作用，轉錄因子Foxp3是Treg細胞的重要調節蛋白，調節Treg細胞的發育和功能[17]，因此miR-125b可能通過上述途徑影響病毒性腦炎患兒機體內Th17/Treg的平衡，從而影響患兒的預后。

此外，本結果還發現，影響病毒性腦炎患兒預后的危險因素主要有意識改變、驚厥持續狀態、腦CT異常、腦MR異常、應激性高血糖和血漿miR-125b水平升高。印澄瑩等[18]的研究發現，意識改變的患者內側前額葉、腦干和胼胝體的損傷較其他部位明顯增高，腦MR也顯示意識障礙患者的執行控制網絡和默認模式網絡的功能連接強度降低，與預后GCS評分有關。腦CT異常和腦MR異常直接或間接說明腦實質受損，病毒性腦炎MR表現為病灶廣泛，可累及各個部位，出現彌漫性腦組織腫脹甚至病灶出血，累及范圍越大，預后越差[19]。驚厥持續狀態可以導致海馬區神經元死亡，從而引起腦損傷，驚厥持續時間和次數都影響患兒的預后[20]。應激性高血糖通常伴有低鈉血癥和低鈣血癥，加速機體內環境穩態失調，導致疾病惡化，此外高血糖可以引發高滲血癥，易引起意識障礙和抽搐[21]，從而影響患兒的預后。本結果還發現，血漿miR-125b水平升高也影響患兒的預后，這可能與miR-125b可引起視黃酸相關的孤兒受體γt和轉錄因子Foxp3表達，進而導致Th17/Treg失衡和炎性反應加重有關。

綜上所述，miR-125b與機體的免疫狀態密切相關，促進Th17/Treg失衡，參與病毒性腦炎的發病過程，此外，意識改變、驚厥持續狀態、腦CT異常、腦MR異常、應激性高血糖和血漿miR-125b水平升高是影響病毒性腦炎患兒預后的危險因素。但miR-125b如何通過機體的免疫反應介導病毒性腦炎的病理過程，還需要進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

朱莉：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;姜遠安、肖冠華：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;何志毅：進行統計學分析；李君軍：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核