ＡＣＣａｓｅＴｒｐ １９９９ Ｌｅｕ突變對菵草種子萌發的影響

尹夢婕 劉國平 李怡慧 姜波 白霜 李凌緒

摘要：為了確定菵（Beckmanniasyzigachne）乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coenzymeAcarboxylase，ACCase）Trp-1999-Leu突變對種子萌發的影響，采用衍生酶切擴增序列多態性法（derivedcleavedamplifiedpolymorphismsequences，dCAPS）從JS-26種群中分離出基因背景一致的1999位突變純合子（1999Trp/Trp，RR）和野生型（1999Leu/Leu，SS），并在室內測定其種子萌發的動態差異，及在pH、水分、鹽等脅迫下的萌發差異。結果表明，Trp-1999-Leu突變能夠提高菵種子的萌發率，使菵種子在偏酸性或偏堿性條件下的萌發率降低;但能顯著提高菵種子萌發對水分和鹽脅迫的耐受力，水勢為-0.4MPa時，RR萌發率比SS高23個百分點，NaCl濃度為80mmol/L時，RR的萌發率為SS的4.4倍。

關鍵詞：菵;乙酰輔酶A羧化酶;Trp-1999-Leu突變;種子萌發

中圖分類號：S451 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2021）12-0044-06

菵（Beckmanniasyzigachne）為禾本科菵屬一年生或越年生雜草，喜濕，是我國稻茬麥田主要雜草之一[1]。精唑禾草靈是乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-coenzymeAcarboxylase，ACCase）抑制劑類除草劑，化學結構上屬于芳氧苯氧丙酸酯類（Aryloxyphenoxypropionates，APP），通過抑制禾本科雜草脂肪酸合成起到除草作用，是我國小麥田苗后選擇性防治菵的主要藥劑之一[2]。目前我國稻茬麥田菵已對精唑禾草靈產生了明顯抗性，靶標酶ACCase特定氨基酸的突變是其重要的抗性機理之一，其中Trp-1999-Leu是菵中最新發現的抗性突變[3-5]。在除草劑存在的情況下，抗性基因可為雜草帶來收益，但在沒有除草劑存在時，可能帶來適合度代價[6]。萌發是雜草重要的生理過程，對植物生長發育有重要影響。本試驗以基因背景一致的ACCasee1999位突變純合體菵（RR）和1999位野生型菵（SS）為材料，研究Trp-1999-Leu突變對菵種子萌發的影響，以期為菵抗性進化、抗性菵治理等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菵（JS-26）種子于2012年6月采集于江蘇省丹陽市，在田間隨機采集50株以上菵種子，置紙袋內，室內晾干，于4℃保存。敏感種群（SD-12）2013年6月采自山東省泰安市，采集、保存等方法同上。

1.2 種子萌發與幼苗培養

取成熟飽滿、大小一致的菵種子置于鋪有濾紙的9cm培養皿內，加入5mL清水，潤濕種子，于光照培養箱中催芽，L∶D=12h∶12h，光照12000Lux，白晝20℃、夜晚10℃，每日換水。胚芽生長至1cm左右時移栽于裝有疏松壤土的花盆中（直徑15cm，高9cm），壤土采自青島農業大學校園，未施用過除草劑。菵置于15～28℃溫室內，自然光照，每兩日澆水一次。用于抗性水平測定的菵每盆移入7株，生長至三葉期間苗，每盆保留5株長勢一致的幼苗;用于衍生酶切擴增序列多態性（derivedcleavedamplifiedpolymorphismsequences，dCAPS）分析的菵每盆移入一株。

1.3 JS-26種群對精唑禾草靈的抗性水平

采用整株法測定JS-26種群對精唑禾草靈的抗性水平，以SD-12種群為對照。將精唑禾草靈（69g/L水乳劑，拜耳）配制成如表1所示的系列濃度，使用移動噴霧塔（3WP-2000，農業農村部南京農業機械化研究所）以Teejet-9503EVS型扇形噴嘴在0.28MPa下噴霧處理，噴液量450L/hm2。每盆作為一個處理，每處理重復3次，以噴施清水為對照。處理21d后，剪取地上部植株稱量鮮重，使用SigmaPlot12.5（Systat）的雙邏輯非線性回歸模型（公式1）計算鮮重抑制中濃度（GR50）。

式中，Y為該除草劑用量下雜草地上部鮮重抑制率;C為劑量反應下限;D為劑量反應上限;X為除草劑用量;GR50為鮮重抑制中濃度;b為斜率。

根據公式2計算抗性水平（RI）。

1.4 ACCase基因克隆與測序

在菵3～4葉期采集葉片約50mg，采用CTAB法提取總DNA[7]。根據Li等[8]的方法擴增菵質體ACCase基因CT區域序列，引物為FP：5′TTTCCCAGCGGCAGACAGAT3′，RP：5′TCCCTGGAGTCTTGCTTTCA3′。PCR 反應體系（25μL）：FP（20μmol/L）1μL、RP（20μmol/L）1μL、dNTPs（0.25mmol/L）2μL、反應緩沖液2.5μL、EasyTaqDNA聚合酶（500U）0.2μL、DNA1μL、雙蒸水17.25μL。反應條件：95℃預變性3min;95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸100s，共35個循環;72℃延伸10min，4℃保溫。反應結束后取PCR產物5μL，在1%瓊脂糖凝膠上140V電泳30min，溴化乙錠（EB）染色后，檢測目的條帶。隨后將擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序，測序結果用DNAMAN9.0（LynnonLLC，SanRamon，CA）進行序列比對分析。JS-26種群共采集25株進行測序比對，取樣后的植株噴施精唑禾草靈觀察表型，劑量為62.1ga.i./hm2。

1.5 dCAPS分析試驗

參考Xu等[9]的方法進行，通過錯配引物引入HindⅢ的酶切位點（A^AGCTT），分析JS-26菵質體ACCase第5996位的SNP（G/T）。使用引物為W1999LF：5′TGATTCCCACGAGCGGTCTGTTCCTCGTGCTGGGCAAAGCT3′（下劃線為錯配的堿基），W1999LR：5′TTGAGTTCCTCTGACCTGA3′。PCR反應體系（25μL）：DNA1μL、W1999LF（10μmol/L）1μL、W1999LR（10μmol/L）1μL、dNTPs（0.25mmol/L）2μL、反應緩沖液2.5μL、EasyTaqDNA聚合酶（500U）0.25μL、雙蒸水17.25μL。反應條件：95℃預變性3min;95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，共34個循環;72℃延伸10min，4℃保溫。經3%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色確認目的條帶后，取PCR反應產物5μL經HindⅢ37℃酶切2h，酶切產物經3%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色后進行分析。經內切酶消化后，野生型（SS）應該有一條390bp的條帶，純合突變型（RR）應該有一條可見的349bp條帶和一條不可見的41bp條帶，雜合突變型（RS）應該同時存在349bp和390bp兩種帶型。根據dCAPS分析結果，將SS和RR分別置于不同溫室培養，收取種子，室內晾干，置4℃待用。

1.6 最適條件下RR、SS型菵種子萌發差異

分別在種子采集當天與室溫儲存4個月后進行試驗，萌發條件同1.2。每皿放入25粒種子，重復4次。胚根或胚芽長度超過種子一半時視為萌發，每天記錄萌發種子數量，并將其移出皿外，連續觀察20d。

1.7 不同pH值環境下RR、SS型菵種子萌發差異

分別配制pH為4、6、8、10的緩沖液[10，11]，按1.2的方法使菵種子在不同pH值緩沖液中萌發，以去離子水（pH=6.5）為對照，每處理重復4次，20d后記錄種子萌發數。

1.8 水分脅迫下RR、SS型菵種子萌發差異

配制不同濃度聚乙二醇-6000（PEG-6000）溶液，使水勢分別為0、-0.1、-0.2、-0.3、-0.4、-0.5、-0.6MPa[12]，按1.2的方法萌發種子，每處理重復4次，20d后記錄種子萌發數。

1.9 鹽脅迫下RR、SS型菵種子萌發差異

配制濃度分別為0、10、20、40、80、160、320mmol/L的NaCl溶液，以蒸餾水作對照，萌發條件同1.2，每處理重復4次，20d后記錄種子萌發數。

1.10 數據處理

試驗整體重復3次，使用SPSS20.0（IBM）對3次試驗數據進行方差齊性檢驗，若3組數據無顯著性差異（P>0.05），將數據合并。使用Sigmaplot軟件（Systat）對種子萌發過程進行非線性擬合。鹽脅迫、水分脅迫和不同pH值條件下萌發率的差異顯著性利用獨立樣本t檢驗（α=0.05）分析。

2 結果與分析

2.1 JS-26種群對精唑禾草靈的抗性水平

整株法測定結果表明（圖1），JS-26種群對精唑禾草靈的GR50值為（3554.08±110.22）ga.i./hm2;SD-12種群對精唑禾草靈的GR50值為（6.29±0.13）ga.i./hm2。可見JS-26種群已對精唑禾草靈產生高水平抗性（RI=565）。

2.2 ACCase基因克隆與測序

擴增產物經電泳分析，發現在約1437bp處獲得目的條帶（圖2）。測序比對后發現，在25株供試植株中，3株ACCase1999位氨基酸密碼子為TTG，編碼色氨酸（Trp），對精唑禾草靈敏感;16株1999位密碼子為TGG，編碼亮氨酸（Leu），6株1999位密碼子為TTG/TGG，編碼色氨酸/亮氨酸（Trp/Leu），均對精唑禾草靈表現出耐受性。Trp-1999-Leu突變已在日本看麥娘等雜草中得到鑒定，可使ACCase對精唑禾草靈等藥劑的敏感性降低，是導致禾本科雜草對芳氧苯氧丙酸酯類除草劑產生抗性的突變位點之一[9]。

2.3 dCAPS分析

反應完成后對擴增產物進行凝膠電泳檢測，可見在390bp處有明顯且唯一的條帶，與預期目標符合，可用于后續試驗。擴增產物經HindⅢ酶切后電泳檢測，結果如圖3所示。泳道3在349bp處有單一條帶，為突變純合子（RR）;2、4、5、6在390bp處有單一條帶，為野生型（SS）;1在349bp和390bp處均有條帶，為突變型雜合子（RS）。應用此方法對JS-26種群96株菵進行檢測，得到RR型（1999Leu/Leu）79株，RS型（1999Leu/Trp）1株，SS型（1999Trp/Trp）16株。

2.4 最適條件下RR、SS型菵種子萌發動態差異

由圖4可知，在種子采集當天進行試驗，RR型菵種子的tG50（萌發率達到50%所用時間）為14.7～16.8d，SS型菵種子的tG50為14.8～15.6d，二者無顯著差異;RR型菵種子最終萌發率（73%）略高于SS型（65%），但差異不顯著。室溫儲存明顯縮短了菵種子萌發所需時間，RR型和SS型菵種子的tG50分別縮短至7.5～8.4d和7.6～9.7d，且無顯著差異;儲存后RR型菵種子萌發率（99%）顯著高于SS型？ 草種子（87%）。可見室溫儲存4個月可顯著縮短菵種子萌發時間，且Trp-1999-Leu突變顯著提高了菵種子萌發率。

2.5 不同pH值下RR、SS型菵種子萌發差異

如表2所示，菵種子的萌發對pH值變化不敏感，在pH為4～10范圍內，兩基因型菵種子萌發率均在70%以上。對比兩基因型菵種子萌發率發現，除pH=6.0時，RR型的萌發率均顯著低于SS型。

2.6 水分脅迫下RR、SS型菵種子萌發差異

菵種子萌發對滲透壓比較敏感，當滲透壓為-0.1MPa時萌發率開始大幅降低，滲透壓低于-0.4MPa時種子的萌發率低于50%，在-0.6MPa時萌發率低于10% （表3）。在滲透壓為-0.1、-0.2、-0.6MPa時，RR型菵種子萌發率與SS型無顯著差異;在滲透壓為-0.3、-0.4、-0.5MPa時，RR型菵種子的萌發率顯著高于SS型，分別高18、23、17個百分點。

2.7 鹽脅迫下RR、SS型菵種子萌發差異

菵種子萌發對NaCl敏感，當NaCl濃度達到20mmol/L時萌發率明顯降低，濃度達到160mmol/L時SS型菵種子不能萌發。RR型菵種子萌發對NaCl的耐受性更強，在NaCl濃度為20、40、80mmol/L時萌發率均顯著高于SS型（表4）。

3 討論與結論

菵是長江中下游地區稻茬麥田的主要雜草之一，已對精唑禾草靈、炔草酯等ACCase抑制劑普遍產生了抗性[13]。質體ACCase特定氨基酸的突變是菵對精唑禾草靈產生抗性的重要機理，已從菵中鑒定出了Ile-1781-Leu、Ile-1781-Val、Trp-2027-Cys、Ile-2041-Asn、Asp-2078-Gly、Gly-2096-Ala等抗性突變[3，4]。質體ACCase1999位氨基酸Trp突變也可能導致對ACCase抑制劑產生抗性，Trp-1999-Cys是1999位最先發現的抗性突變形式，Liu[14]、Jang[15]等將該突變導入酵母，重組酵母對精唑禾草靈和精喹禾靈產生了抗性。Liu等[5]證實菵Trp-1999-Leu突變對精唑禾草靈、精喹禾靈、唑酰草胺等具有雙環芳香基的APP類品種具有中等至高水平的抗性，對炔草酯等僅具單環芳香基的APP類品種無抗性。

為了應對不同生境的選擇壓力，雜草在不同空間中經常發生生態型分化，使不同地理種群在許多與適合度代價相關的位點上表現出遺傳變異[16，17]。因此，控制遺傳背景是適合度代價研究的重要前提。從單個群體中鑒定、分離抗性和敏感個體是常用的控制遺傳背景的方法之一[18，19]。本研究采用dCAPS法從JS-26種群鑒定分離出1999位抗性純合子（1999Leu/Leu，RR）和敏感野生型（1999Trp/Trp，SS），獲得了遺傳背景一致的材料，消除了其他位點的干擾。

抗性雜草種子的萌發動態會影響其在田間的發生發展[20]。本研究發現，在最適條件下，儲存可使菵種子萌發時間縮短，且RR型萌發率顯著高于SS型。Du等[21]研究了不同突變對菵種子萌發的影響，發現Ile-1781-Leu、Trp-2027-Cys、Ile-2041-Asn、Asp-2078-Gly、Gly-2096-Ala等突變對儲存后菵種子萌發的tG50沒有顯著影響。Vila-Aiub等[22]發現ACCaseIle-1781-Leu突變使大穗看麥娘（Alopecurusmyosuroides）種子萌發的tG50升高，Ile-2041-Asn突變則對種子萌發沒有影響。可見同一突變形式對種子萌發的影響在種間呈現一定程度差異。

菵種子萌發對酸堿度不敏感，pH值4～10范圍內均適宜其萌發，在偏酸性（pH=4）或偏堿性（pH為8～10）條件下，RR種子萌發率顯著低于SS。干旱脅迫和鹽脅迫對菵種子萌發影響顯著。滲透壓達到-0.1MPa時菵種子萌發率迅速下降，與Du等[21]的結果一致。在本研究中，ACCaseTrp-1999-Leu突變增強了菵種子對干旱脅迫的耐受力，在滲透壓為-0.3、-0.4、-0.5MPa時，RR型萌發率顯著高于SS型。NaCl濃度對菵種子萌發也有一定影響，濃度達到20mmol/L時，菵種子萌發率出現明顯下降。與SS型相比，RR型對鹽脅迫的耐受性更高，說明ACCaseTrp-1999-Leu突變提高了菵種子萌發對鹽的耐受力。Du等[21]研究了ACCase不同突變在干旱脅迫和鹽脅迫下對菵種子萌發的影響，發現Ile-1781-Leu突變可提高干旱脅迫下菵種子的萌發率，在野燕麥（Avenaludoviciana）上的研究則表明Asn-2041-Ile突變不會影響種子萌發對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性[23]。

本試驗表明菵ACCaseTrp-1999-Leu突變降低了菵種子對酸堿的耐受性，但增強了對干旱脅迫和鹽脅迫的耐受性，對抗性菵的分布可能會產生一定影響。