人羊膜間充質干細胞旁分泌對成骨細胞的影響

王貴玲，洪 滔，淦 岷，仇麗鴻

腫瘤或炎癥等骨破壞性疾病可能引起牙槽骨較大面積骨缺損，往往需要外界干預。缺損區成骨細胞對微環境的改變很敏感，又是直接調節骨形成的重要細胞，所以它的生物活性在骨組織修復中具有重要作用[1]。如何充分調動缺損區成骨細胞生物活性對骨缺損的修復再生具有重要意義。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，在骨缺損修復治療中療效顯著[2-3]。早期人們認為MSCs主要作為組織修復中的種子細胞，利用其成骨分化能力發揮作用，但近年來研究結果顯示MSCs并非直接參與組織修復的主要細胞，而是主要通過分泌相關生物活性因子，改變機體局部微環境，即通過旁分泌機制誘導機體自身細胞歸巢并調節細胞增殖分化，進而發揮對骨組織的修復作用[4-5]。人羊膜間充質干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)因取材方便，且無倫理限制，成為MSCs理想的細胞來源[6-7]。本研究通過收集人羊膜間充質干細胞條件培養基(condition medium，hAMSCs-CM)并作用于人成骨樣細胞系MG63，進而研究hAMSCs對成骨細胞的旁分泌作用，為hAMSCs在牙槽骨再生修復中的進一步應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12培養基(Gibco，美國)，低糖DMEM培養基、胎牛血清(FBS)(Hyclone，美國)，膠原蛋白酶Ⅳ、pNPP試劑盒(Sigma，美國)，胰蛋白酶(Sangon，中國)，MTT試劑盒(Invitrogen，美國)，CD29、CD105、CD44、CD45、CD31、CD49d、SSEA3、SSEA4、CD34、HLADR抗體(BD Pharmingen，美國)，BCA試劑盒(碧云天，中國)。

1.2 細胞培養

人成骨樣細胞系MG63細胞(購自中國科學院細胞庫)，用含10% FBS的低糖DMEM培養基于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。細胞融合度達90%后按4×104個/cm2傳代。

1.3 hAMSCs原代提取

羊膜樣本由中國醫科大學附屬第一醫院產科提供，產前檢測無傳染性疾病，并經產婦知情同意。在胎盤娩出10 min內，從胎盤上鈍性分離羊膜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗后，浸泡于含1 000 U/mL慶大霉素和2.5 μg/mL 二性霉素B的PBS中，冰盒2 h內運至實驗室。剪取面積約5 cm×5 cm大小羊膜，刮凈表面的絨毛膜及殘留血塊，放入離心管中，加入約20 mL的0.25%胰蛋白酶，37 ℃水浴消化20 min兩次，后剪碎放入離心管中，加入10 mL 1 g/L的膠原蛋白酶Ⅳ，37 ℃水浴約60 mim，200目不銹鋼網過濾，1 000 r/min離心5 min，可觀察到細胞沉淀即為hAMSCs。用含10% FBS的DMEM/F12培養液將細胞沉淀重懸并接種，第二天可觀察細胞貼附情況，1～2 d后換液，長滿后傳代,之后換用含10% FBS的低糖DMEM培養。取生長狀態良好的第3～5代hAMSCs進行后續實驗。

1.4 流式鑒定原代hAMSCs細胞表面標記物表達

取第4代hAMSCs，消化離心后冷PBS清洗2次，加100 μL冷PBS重懸細胞，細胞數不少于5×105個/管，每管各加5 μL細胞表面標記物抗體，分別為CD29、CD105、CD44、CD49d、SSEA3、SSEA4、CD34、HLADR，另設空白對照，冰上避光孵育30 min，洗滌2次后300 μL PBS重懸細胞沉淀，換用流式管，流式檢測儀檢測。

1.5 收取hAMSC-CM

取第3～5代hAMSCs，待其細胞融合度達90%左右時，換用新鮮培養液，24 h后收取培養上清，1 500 r/min離心5 min去沉淀后分裝，-20 ℃保存備用，與新鮮培養液1∶1混合后作為hAMSC-CM用于后續實驗，并以新鮮培養液作為陰性對照組。

1.6 MTT檢測hAMSC-CM對MG63增殖的影響

MG63按2×103個/孔接種于96孔板中，第2天換用hAMSC-CM，之后1～4 d內每隔24 h MTT法檢測細胞增殖活力。按試劑說明書操作，1.5 h后酶標儀490 nm波長下檢測光密度(OD值)。

1.7 Transwell檢測hAMSC-CM對MG63遷移的影響

MG63消化離心后按1×106個/mL重懸于不含血清培養基中，選用24孔板Transwell小室，下室加入600 μL hAMSC-CM，取100 μL細胞懸液(約1×105個)置于上室，觀察無氣泡后放回細胞培養箱。2.5 h后甲醇固定1 min，蘇木精-伊紅染色，棉花棒擦去小室上層細胞，晾干后顯微鏡下隨機取7個視野拍照并計數穿膜細胞數。

1.8 pNPP法檢測細胞內ALP表達活性

MG63融合度達90%后，換用hAMSC-CM，5 d后，pNPP法檢測細胞內ALP表達[8]。每孔加40 μL RIPA(加蛋白酶抑制劑PMSF)裂解細胞提取細胞質蛋白。取10 μL蛋白裂解液于96孔微板中，另加90 μL pNPP溶液，迅速酶標儀405 nm波長下檢測各孔OD值作為Ainitial。37 ℃溫箱中孵育tx=30 min后再次檢測405 nm波長下OD值作為Afinal。按公式計算ALP活性：ALP 活性=10×((Afinal-Ainitial)/tx) ×R/18.45(其中10代表稀釋倍數；R為路徑長度，在96孔板、100 μL反應體系中約為0.31 cm；18.45代表消光系數)。

同時取1 μL蛋白裂解液，按BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度(mg/mL)，最后將計算得到的ALP活性除以蛋白量后得到標準化的ALP活性(U/g)。

1.9 統計學分析

實驗重復三次，數據均以均值±標準差表示，SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據采用獨立樣本t檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hAMSCs表面標志物鑒定

hAMSCs呈典型的成纖維樣細胞形態，漩渦狀生長(圖1A)。流式結果(圖1B)顯示，人羊膜間充質干細胞陽性表達CD29、CD105、CD49d、CD44；陰性表達CD34、CD45、CD31和HLADR，表明hAMSCs具有間充質干細胞一般特性。

A:hAMSCs形態觀察( ×100)；B: 流式細胞儀檢測hAMSCs表面標志物表達圖1 hAMSCs細胞鑒定Fig.1 Identification of hAMSCs

2.2 hAMSC-CM對MG63增殖能力的影響

hAMSC-CM作用于MG63后，與陰性對照組相比，連續3 d均可顯著促進細胞增殖(P<0.05)，第4天時，細胞增殖增加無顯著統計學差異(圖2)。

2.3 hAMSC-CM對MG63遷移能力的影響

Transwell遷移模型2.5 h后，hAMSC-CM組MG63遷移細胞計數為117.60±14.54，顯著高于對照組的20.20±10.38，表明hAMSC-CM可顯著增強MG63遷移能力(P<0.05)(圖3)。

2.4 hAMSCs-CM對MG63細胞ALP活性的影響

hAMSCs-CM連續培養MG63細胞5 d后，細胞內ALP表達明顯強于對照組(P<0.05)(圖4)，提示hAMSCs-CM可顯著促進MG63細胞成骨分化。

與對照組比較，*：P<0.05圖2 hAMSC-CM對MG63增殖能力的影響Fig.2 Effect of hAMSC-CM on MG63 cell proliferation

A：對照組MG63遷移細胞情況；B：hAMSC-CM細胞遷移情況( ×100)；C：不同組遷移細胞數比較，與CON組比較，*：P<0.05圖3 hAMSC-CM對MG63遷移能力的影響Fig.3 Effect of hAMSC-CM on MG63 cell migration

與CON組比較，*：P<0.05圖4 hAMSCs-CM對MG63中ALP活性的影響Fig.4 Effect of hAMSC-CM on ALP activity in MG63

3 討 論

MSCs廣泛存在于全身多種組織中，最早是由骨髓中提取出來[9]。然而骨髓間充質干細胞來源有限，且提取方法具有侵入性，而羊膜取材方便，無倫理限制，且hAMSCs增殖及成骨分化能力比BMSCs更強[6-7,10]。本研究及既往研究均表明，hAMSCs不表達免疫因子HLA-DR、CD14，也不表達協同刺激分子CD80、CD83、CD86、CD40L等，具有低免疫原性和免疫調節作用[11-12]，可以作為間充質干細胞臨床應用的理想細胞來源。

近年來人們研究證實，在骨組織工程中植入的MSCs主要通過旁分泌作用促進骨組織修復再生，且MSC-CM與MSCs具有相似的骨誘導作用[13-14]，這為MSC-CM在臨床應用提供了理論基礎。研究表明，MSCs可通過分泌血小板生長因子、轉化生長因子beta、血管內皮生長因子等可溶性生長因子，或通過胞外囊泡攜帶并傳遞遺傳信息等多種可能的途徑改變組織細胞所處的微環境，發揮旁分泌作用[15-17]。

本研究通過提取hAMSC-CM作用于人成骨樣細胞系MG63，檢測其對成骨細胞增殖、遷移及分化功能的影響。本研究證實hAMSC-CM對成骨細胞增殖和遷移具有顯著促進作用，ALP是成骨細胞分化早期的標志物，本研究通過pNPP法檢測hAMSC-CM培養5 d后成骨細胞內ALP活性，在蛋白水平上驗證了hAMSC-CM對成骨細胞分化的顯著促進作用。由此提示hAMSCs可通過旁分泌作用增強成骨細胞生物活性，但具體作用的生長因子及其相關機制尚需進一步研究。

目前對于hAMSCs的研究主要把它作為骨組織工程的種子細胞，研究其自身成骨分化或對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響[18-19]。有研究提示hAMSCs與成骨細胞共培養后，可促進成骨細胞分化指標表達，但文中并未明確標明實驗所用成骨細胞系的種類，且僅涉及hAMSCs對成骨細胞分化功能的影響[20]，同時培養兩種細胞的實驗操作難度大。有體內研究發現植入的MSCs在體內存活時間短、分化活性差[13-14]，且MSCs在儲存、培養和應用操作中相對復雜，而MSC-CM可更方便臨床應用，且不用擔心體內成瘤的風險[21]，所以在組織修復的體內應用中，MSC-CM有其獨特的優勢。

綜上所述，本研究通過提取并鑒定hAMSCs，收取hAMSC-CM作用于成骨細胞，可顯著增強成骨細胞生物活性，為hAMSCs在骨組織修復領域的進一步研究提供了理論基礎。